ARPE-19 細胞における SARS-CoV-2 スパイク偽ウイルス粒子感染は、主に LDLR によって媒介されるダイナミン依存性プロセスです

で発表された最近の研究では、 国際分子科学ジャーナル研究者らは、レンチウイルスのシュードビリオンが重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) スパイク (S) とシュードタイプであることを報告しました。 糖タンパク質 培養された ARPE-19 ヒト網膜色素上皮細胞に感染する可能性があります。

この研究では、抗低密度リポタンパク質受容体 (LDLR)、抗カベオリン 1、抗ダイナミン抗体、コレステロール除去剤、および LDLR 低分子干渉リボ核酸 (siRNA) 分子によってこの感染がどのようにブロックされるかを調査しています。

勉強： 低密度リポタンパク質受容体（LDLR）は、眼細胞におけるSARS-CoV-2スパイクタンパク質で偽型されたレンチウイルス粒子の内部移行に関与する。 画像クレジット: PHOTOCREOMichal Bednarek/Shutterstock.com

バックグラウンド

SARS-CoV-2 の宿主への侵入には、アンジオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 受容体が関与します。 ただし、ACE2 の発現が低い場合でも、脂肪組織や眼の強膜などの組織や細胞に感染する可能性があります。 SARS-CoV-2 は、T リンパ球と上皮細胞にも独立して感染する可能性があります。

AXL、ニューロピリン-1、ベイシジン、アンジオテンシン II 受容体 1 型 (AT1)、バソプレシン V1b 受容体 (AVPR1B) などの追加の受容体は、さまざまな細胞への侵入を促進します。 クラスリン依存性経路やカベオラ依存性経路などのエンドサイトーシス経路が、最近の研究で特定されています。

上皮成長因子受容体 (EGFR)、AXL、LDLR などの他の候補受容体も予測されています。

研究について

本研究では、研究者らは、カベオラおよびカベオラ内のLDLR受容体が、眼球細胞を含む特定の器官に感染するために利用されるSARS-CoV-2受容体依存性エンドサイトーシス機構の構成要素であることを発見した。

研究者らは、SARS-CoV-2がRPE細胞培養モデルであるARPE-19のどこに侵入するか、またコレステロールに富む脂質ラフトがARPE-19ヒト網膜色素上皮細胞のSARS-CoV-2感染に関与しているかどうかを調査した。

ビメンチンに対する抗体、および SARS-CoV-2-ニューロリピン-1、EGFR、AXL、および分化クラスター 147 (CD147) に対する追加の推定受容体潜在性が調査されました。

我々は、網膜色素上皮細胞のコレステロール恒常性を破壊するためにシクロデキストリンとオキシステロールを採用しました。 ARPE-19 細胞は、SARS-CoV-2 ネイティブスパイクシュードタイプレンチウイルス粒子に感染させた後、0.0 ～ 10.0 M 25-HC とともにインキュベートしました。

ロバスタチンはコレステロールの存在を評価するために使用されました。 0.0～10.0 M ロバスタチン単独での 6 時間のプレインキュベーション セッションに続いて、ロバスタチンおよびシュードビリオンとの 48 時間の共インキュベーション期間が続きました。

研究者らは次に、細胞を0.0～10μMの合成LXRアゴニストGW3965とプレインキュベートすることにより、LXR受容体に対する25-HCのアゴニスト活性がウイルス感染の予防に関与しているかどうかを試験した。

研究者らは、カチオン性両親媒性化学物質であるクロルプロマジン (CPZ) をマイクロモル濃度 (50 ～ 100 M) で使用して、いくつかの細胞膜タンパク質の CME をブロックしました。 次に研究者らは、抗カベオリン-1抗体を使用して、カベオラ依存性のエンドサイトーシスを調べました。

抗 LDLR 抗体を使用して、低密度リポタンパク質受容体仮説を調査しました。 研究者らは、ウイルス感染に応答したSARS-CoV-2ウイルス受容体の適応進化を調べるために、ACE2受容体とLDLR受容体のポジティブ選択を評価した。

シュードウイルス 感染および細胞生存率アッセイ、イムノブロット分析、定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)、および多重アラインメント分析を、siRNA 処理およびシュードビリオン感染ヒト網膜色素上皮細胞に対して実施しました。

結果

この発見は、ARPE-19細胞におけるSARS-CoV-2の内在化が、LDLRを介したカベオラ媒介エンドサイトーシスを介して起こったことを示した。

ACE2を抑制する抗体療法は、SARS-CoV-2 Sタンパク質シュードビリオン感染を防ぐことができず、ビメンチンなどの細胞外コレステロール密度の高い脂質ラフトタンパク質分子の遮断も防ぐことができなかった。

研究チームはまた、さまざまなオキシステロール 25-ヒドロキシコレステロール (25-HC) およびシクロデキストリンが ARPE-19 細胞における偽ビリオン感染を減少させることを実証し、感染におけるコレステロール恒常性の役割を示しました。

しかし、ロバスタチンのインキュベーションは感染に対して認識できる影響を及ぼさなかったため、25-HC の作用はコレステロール生成を介したものではない可能性が最も高いです。 フロチリンおよびクラスリンベースのラフトは偽ビリオン感染には関与していませんでした。

ダイナミン I および II、および非競合的なダイナミン グアノシン トリホスファターゼ (GTPase) 阻害剤である dynasore に対する抗体は、SARS-CoV-2 S 糖タンパク質偽ビリオンの侵入を阻止しました。

カベオリン-1に対する抗体は、ヒト網膜色素上皮細胞におけるスパイク糖タンパク質シュードタイプレンチウイルスSARS-CoV-2感染を大幅に阻害した。 しかし、よく知られているカベオラベースのエンドサイトーシス阻害剤であるナイスタチンは、どの用量でも感染症に影響を与えませんでした。

また、5.0 mM 濃度までの網膜色素上皮細胞のスパイク糖タンパク質シュードタイプレンチウイルス SARS-CoV-2 感染に対する GW3965 の有意な効果はありませんでした。

クロルプロマジンとフルナリジンの阻害効果は、24.0 時間でシュードビリオン感染に対して観察されましたが、48.0 時間では観察されませんでした。 この発見は、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質シュードビリオン感染がダイナミンに基づいており、主に網膜細胞のLDLRによって制御されていることを示しており、これはLDLRを標的とした低分子干渉RNA分子を用いた遺伝子サイレンシングによって検証された。

スクランブル低分子干渉 RNA 分子またはブランクトランスフェクションと比較して、低密度リポタンパク質受容体低分子干渉 RNA 分子による治療後の SARS-CoV-2 スパイク糖タンパク質シュードタイプレンチウイルス SARS-CoV-2 感染において、統計的に有意な減少が観察されました。

細胞における低密度リポタンパク質受容体の発現は、スパイク糖タンパク質シュードタイプのレンチウイルス粒子の取り込みと直線相関を示しました。

結論

研究結果に基づくと、LDLR受容体に関連するウイルスのカベオラ媒介トランスサイトーシスは、ARPE-19などのACE2を欠く細胞におけるSARS-CoV-2内部移行の代替機構を表す可能性が高い。

科学者らは、代謝機能障害へのLDLR受容体の関与が、肥満および糖尿病患者において重篤な新型コロナウイルス感染症を発症するリスクを高める可能性があると仮説を立てており、さらなる研究が必要であるとしている。