RPA の全体的なワークフロー –Pf前乗り場
迅速かつ高感度のジェノタイピングのために Pfcrt 現場での変異ハプロタイプ、RPA と組み合わせてトリガーされるデュアルシグナル バイオセンサー検出プラットフォーム PfAgoが開発されました（図1）。マラリアが疑われる患者から血液サンプルを収集した後、Chelex-100 法によりゲノム DNA を迅速に抽出しました。 [22]。標的配列は RPA テクノロジーによって増幅されます。その後、この製品は次の方法で特定されました。 Pfアゴの谷間系。 gDNA 変異 (gDNA-M) と gDNA 共通 (gDNA-C) のガイドにより、 PfAgo は、gDNA-M 配列に相補的な増幅産物フラグメントの 1 本の鎖を特異的に切断できます (最初の切断)。この切断により、5’リン酸化された別の ssDNA フラグメントが生成され、これがガイドとなる新しい gDNA として機能します。 Pf2回目の劈開を行う前に。 2 番目の切断の基質は蛍光プローブ、ssDNA レポーターです。そのマーカーは ROX 蛍光体と BHQ2 クエンチャーです。蛍光レポーターは、最初の切断の生成を確認するように設計されました。による蛍光レポーターの特異的切断 PfAgo は BHQ2 から ROX を放出し、蛍光シグナルを生成します。増幅された CVMNK フラグメントの場合、gDNA-M に相補的な鎖が存在しないため、最初の切断は起こらず、蛍光シグナルはありません。さらに、対応する gDNA 野生型 (gDNA-W) 株と、野生型株用の FAM 蛍光色素および BHQ1 クエンチャーを備えた別のレポーターを設計しました。 CVMNK 増幅産物が存在すると、別の種類の蛍光シグナルが生成されます。これらの方法を使用することにより、直交配列を含む同じ反応混合物中で CVMNK フラグメントと CVIET フラグメントを同時に検出しました。 PfAgo タンパク質と直交システムは、互いに干渉することなく 2 つの独立したチャネル信号を生成しました。
図1
RPA によってトリガーされるデュアルシグナル バイオセンサー検出プラットフォームPf前に Pfcrt ハプロタイプ検出
PfAgoタンパク質の発現と精製
プライマーの設計とスクリーニング
のシーケンス Pfcrt の遺伝子 (PF3D7_0709000) P。 鎌 3D7 株は PlasmoDB から取得しました (http://plasmodb.org/plasmo/リリース 56、2022 年 2 月 15 日）。一連の RPA プライマー (F1 ～ F3、フォワード、R1 ～ R3、リバース) は、RPA 設計マニュアル (www.twistdx.co.uk）および Primer-BLAST は、Primer Premier 5.0 ソフトウェア（Premier Biosoft、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）と BLAST（Basic Local Alignment Search Tool、National Center for Biotechnology Information）グローバル アライメントを組み合わせたものです。 3 つのフォワード プライマーと 3 つのリバース プライマーを 9 つの組み合わせ (表 S1) にクロスアセンブリし、TwistAmp® Basic Kit (TwistDx、ケンブリッジ、英国) を介して行われた RPA 増幅に使用しました。 50 μL の最終反応混合物には、各フォワード プライマーおよびリバース プライマー (10 μM) 2.4 μL、MgAc (280 mM) 2.0 μL、再水和緩衝液 29.5 μL、ゲノム DNA 2.0 μL、凍結乾燥酵素ペレット、および遊離水が含まれていました。反応混合物を１０回上下させて完全に混合した。反応時間は 20 分、反応温度は 37 °C でした。等温増幅は、Life Touch Thermal Cycle (Bioer Technology Co., Ltd.、中国) で実行され、その後、すべての増幅産物は TIANquick Midi Purification Kit (TIANGEN Biotech Co., Ltd.、北京、中国) を介して精製されました。 2% アガロースゲルで分析。
ガイド DNA および ssDNA レポーターの設計とスクリーニング
ガイド DNA (gDNA) は、 PfAgo 切断システムは、ターゲット内の特定の配列 (この研究の場合、変異型 CVIET フラグメントを含む配列) の特異的認識を誘導するため、 PfAgo、これによりヌクレアーゼが活性化されます。最適なプライマーの増幅領域の配列に応じて、2 つの組み合わせ、5′-リン酸化 gDNA PfAgo (長さ 16 nt) および両端に FAM-BHQ1 または ROX-BHQ2 修飾を備えた ssDNA レポーターを、合計 3 つのグループに対して手動で設計しました (表 S1)。 ssDNA レポーターには、2 回目の切断で gDNA 切断産物と整列する可能性がある 16 nt 領域がありました。使用したオリゴヌクレオチドはすべて表S1にリストされており、中国のGENEWIZ (蘇州) Co., Ltd.によって合成されました。選択したプライマーの増幅産物を標的フラグメントとして使用し、3 つのグループの gDNA をスクリーニングしました。 Pf先ほどの切断実験。最適な gDNA の組み合わせは、次のものを明確に区別できる必要があります。 Pfcrt-CVMNKと Pfcrt-CVIET、ターゲットフラグメントは明確に切断されるはずです。
プラスミド構築
の 515 bp 断片を含む 2 種類のプラスミド Pfcrt 遺伝子は、中国の GENEWIZ (Suzhou) Co., Ltd. によって設計および構築されました。使用した 2 つの組換えプラスミドは次のとおりです。 pUC57/Pfcrt-CVMNK (野生型) および pUC57/Pfcrt-CVIET（変異型）。その後、遺伝子はサンガー配列決定によって検証されました。 DNA濃度は、NanoDrop™ ND-2000分光光度計(Thermo、ウィルミントン、米国)を介して定量されました。プラスミド DNA の量は次の式で計算しました: プラスミド DNA コピー数 (コピー/μL) = (OD260 × 10−9 × 6.02 × 1023)/(n × 660)、ここで nはプラスミドの長さを表します。上記のプラスミドを使用して、広範囲の濃度 (1.8 × 104 ～ 1.8 × 1010 コピー/μL) をカバーする 10 倍連続希釈を実行しました。
RPA-Pf前プラットフォーム切断アッセイ
他の研究結果を参考にすると、 [19, 23,24,25,26]RPAの反応系PfAgoプラットフォームが最初に設立されました。 25μL PfAgo 反応混合物には、精製 RPA 生成物 4 μL、RPA 生成物 6 μL (200 U/L) が含まれていました。 Pf前に、gDNA-common (gDNA-C1) 2 μL (20 μM)、gDNA-WT (gDNA-W) 1 μL (20 μM)、gDNA-MT (gDNA-M) 1 μL (20 μM)、各シグナル生成 ssDNA レポーター (Probe-W1 および Probe-M1) 1 μL (10 μM)、3 μＬ（４０ｍＭ）のＭｎＣｌ２、４μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏおよび２μＬのエンドヌクレアーゼ反応緩衝液（１５ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ）。完全に混合した反応混合物を SLAN-96S リアルタイム PCR 検出システム (Shanghai Honshi Medical Technology Co., Ltd.、上海、中国) で 95 °C で 30 分間インキュベートした後、FAM と ROX の二重蛍光シグナルが検出されました。 30 秒間隔で記録されました。反応後、青色発光フィルター (470 nm/520 nm) および緑色発光フィルター (530 nm/600 nm) を備えた BLT GelView 6000Plus (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd.、広州、中国) で反応チューブを観察しました。 nm）、または暗く限られた空間で単純な紫外線（UV）ランプで直接照射し、肉眼で観察します。
の最適化 Pf切断反応前
RPA の全体的なパフォーマンスを向上させるには、Pf反応前、gDNA、プローブ、MnCl2、および Pf以前は最適化されました (補足資料)。この研究では、蛍光曲線と蛍光管シグナルを観察することによって最適な条件を決定しました。サポート情報で説明されているように、一連の最適化実験を行った後、統合 RPA-Pf谷間プラットフォームが確立された前。
尿素変性ページ
の PfAgo 切断産物は、尿素 PAGE ゲルを介して検証されました。尿素-PAGE 混合物は 3 層で構成されていました。最下層は 15% 尿素-PAGE (15% 尿素-PAGE ゲル溶液 2.5 mL、10% APS 12.5 μL、TEMED 2.5 μL)でした。中間層は12%尿素-PAGE（12%尿素-PAGEゲル溶液、4.0mL;10%APS、20.0μL;TEMED、4.0μL）であった。上層は濃縮ゲルであった（尿素、１．４７ｇ；ＰＡＡ、３５０μＬ；５％ＴＢＥ、７００μＬ；ＡＰＳ、３５μＬ；およびＴＥＭＥＤ、３．５μＬのｄｄＨ２Ｏを３．５ｍＬに添加）。使用前に尿素 PAGE を 200 V で 30 分間実行し、サンプルを 200 V で 15 分間、150 V で 30 分間負荷しました。電気泳動後、尿素 PAGE ゲルを PAGE 染色液 (Zhongke Ruitai (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.、北京、中国) で 30 分間脱色し、画像化しました。
ネステッド PCR とシーケンス
感度の検証
の pUC57/Pfcrt-CVIETおよび pUC57/Pfcrt-CVMNK プラスミドを勾配希釈し (濃度範囲 1.8 × 104 ～ 1.8 × 1010 コピー/μL)、RPA の感度を検証するために使用しました。Pfアゴプラットホーム。さらに、混ぜ合わせたのが、 pUC57/Pfcrt-CVIETおよび pUC57/Pfcrt-CVMNK プラスミドを使用し、勾配希釈を実行しました (濃度範囲は 1.8 × 104 ～ 1.8 × 1010 コピー/μL)。 RPA の感度Pf単一の反応システムで野生型株と変異株を同時に検出するための Ago プラットフォームが検証されました。 RPAは、PfAgo プラットフォームは最適な条件下で検証されました。検出限界 (LOD) は、蛍光シグナルが最も低く、反応時間が最も長いプラスミドの濃度として定義されました。 RPA の感度PfAgo プラットフォームは検出閾値の観点から測定され、評価基準としても使用されました。さらに、濃度を薄めました。 pUC57/Pfcrt-CVMNKと pUC57/Pfcrt-CVIET プラスミドを 1.8 × 105 コピー/μL、および 1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、および 10 μL pUC57/Pfcrt-CVIET プラスミドを混合した pUC57/Pfcrt-総量100μLのCVMNKプラスミド。これらの混合プラスミドをテンプレートとして使用すると、RPA のパフォーマンスがPf 低濃度の変異型を検出するための Ago プラットフォームを評価しました。
臨床評価
データ分析
実験データは SPSS 22.0 (SPSS, Inc.、米国イリノイ州シカゴ) で分析されました。あ P価値
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2024-11-24 18:38:00