学習の場
フィールドワークは、中国農業科学院草原研究所実験実証基地内の草原（北緯40度36度、東経111度45度）で実施しました。 この地域は大陸性温帯モンスーン気候に属し、年間平均降水量は約 200 トンです。 標高は約400 mm、年間平均気温は約200 mです。 6.9℃。 主要な植物種は Leymus chinensis、Stipa capillata、Cleistogenes squarrosa、Medicago sativa です。 私たち自身の捕獲記録によると、近年ここで最も優勢なげっ歯類種は S. dauricus です。 シマハムスター (Cricetulus barabensis) やスナネズミ (Meriones Unguiculatus) などの他のげっ歯類も記録されましたが、生息数は比較的少なかったです。 私たちの観察によると、草原のケナガイタチ (Mustela eversmanii)、アカギツネ (Vulpes vulpes)、イエイヌ (Canis lupus Familyis) が、S. dauricus を食べる主な捕食者です。 [32]。 ここでは春と夏に牛の放牧が一般的であり、その結果平均草丈は約20cmになります。 高さは 20 cm、平均植生率は 45% です。
実験手順
2023 年 7 月中旬、調査地域内にある 1 ヘクタールの敷地 2 か所で、第 1 回の生体捕獲を実施しました。 この季節、ほとんどの S. dauricus は生殖能力がありませんでした。 2 つのサイトは、植生、地形、げっ歯類の密度の点で同等でした。 サイト間のサンプリングの独立性を確保するために、最も近いサイト間の距離は 400 m でした。 生の落花生を餌としたシャーマン生トラップ（10×10のグリッドに配置、隣接するトラップ間の間隔は10メートル）を100個設置しました。 S. dauricus は昼行性であるため、トラップは 07:00 から 19:00 (北京時間) の間に開けられました。 このライブトラップのラウンドは 4 日間連続で続きました。 すべての罠を 2 時間ごとにチェックし、必要に応じて罠に餌を戻しました。 捕獲された S. dauricus はすべて、すぐに別々の綿袋に入れられ、私たちの研究室に持ち帰りました。
合計 59 匹の S. dauricus (雄 27 匹、雌 32 匹) が、最初のライブトラップで捕獲されました。 小動物用に設計されたマルチチャンネル麻酔器（R550IE、RWD Life Science Co., Ltd.、深セン、中国）を使用し、イソフルランを使用して各個体を麻酔しました。 外部寄生虫を収集するために、目の細かい櫛とピンセットを使用して、各 S. dauricus の体表を注意深くスキャンしました。 ジリスを入れる綿袋の内側も調べました。 S. dauricus から収集したすべての外部寄生虫を、別の 5 ml 遠心分離管に入っているエタノール (95%) に直ちに入れました。 すべての S. dauricus は、電子天秤を使用して 0.1 g 単位まで秤量され、個体識別のためにつま先を切り取られ、その後、自由に餌 (ピーナッツ、アルファルファの葉、および市販のペレット) を摂取できる状態で、個別のプラスチックの箱に 72 時間保管されました。そして水。 この期間中、S. dauricus は異常な行動や健康上の問題を示しませんでした。
正式な実験には、52 人の成人個体 (体重 100 g 以上、男性 23 人、女性 29 人) 全員を使用しました。 各ジリスは、対照群 (テストステロン注射なし、雄 11 匹、雌 14 匹) と治療群 (テストステロン注射あり、雄 12 匹、雌 15 匹) の 2 つの群のうちの 1 つにランダムに割り当てられました。 捕獲後の翌日の 15:00 ～ 16:00 に、各実験動物から新鮮な糞便サンプル (通常 0.2 ～ 0.3 g) を収集しました。 すべての糞便サンプルを別々の 5 ml 遠心分離管に入れ、すぐに -80 °C で冷凍保存しました。 捕獲から約72時間後、各個体に一定量の茶油（対照群）または一定量のテストステロンと油の混合物（茶油1mlあたりウンデカン酸テストステロン10mg）を筋肉注射した。 注射から合計 1 時間後、すべての個体を捕獲された場所に放しました。
合計 10 日後、実験動物を再捕獲するための 2 ラウンド目 (連続 5 日間) の生け捕りを実施しました。 生きた捕獲、麻酔、外部寄生虫の収集、糞便サンプルの収集、および動物の維持の手順は、最初のラウンドと同様でした。 合計 28 匹の S. dauricus が再捕獲されました (対照群からは雄 6 匹と雌 7 匹、治療群からは雄 5 匹と雌 10 匹)。 経験豊富な分類学者 (Jian-Jun Wang) は後に、二分キーに基づいてすべての外部寄生虫を特定しました。 実験手順全体は、米国哺乳類学者協会によって承認されたガイドラインに準拠しました。 [34] および中国農業省北京獣医師動物福祉委員会規則（中国、北京）。
ホルモンの抽出と分析
私たちは通常、Li et al. が使用したプロトコルに従いました。 [35] いくつかの変更を加えて、糞便サンプルからテストステロンを抽出します。 合計 56 個の糞便サンプルがホルモン分析に使用されました (つまり、再捕獲された 28 人から採取されたサンプル、1 人あたり 2 個のサンプル)。 湿った糞便を使用したため、サンプル間の水分含有量の変動を考慮する必要があります。 したがって、各糞便サンプルから 2 つの糞便サブサンプル (それぞれ重量約 0.1 g、以下サブサンプル A および B) の重量を同時に測定しました。 サブサンプル B は水分含有量の測定に使用され、乾燥オーブンで 24 時間乾燥する前後で重量を測定されました。 次に、水分含有量の値を使用して、関連するサブサンプル A の湿潤サンプル重量を乾燥重量に換算しました。
サブサンプル A をホルモン抽出に使用し、別の 10 ml 遠心分離管に入れました。 各チューブにメタノール 4 ml と蒸留水 1 ml を加え、30 分間ボルテックスしました。 次に、各チューブに 2.5 ml の石油エーテルを加えて、チューブから脂質を除去しました。 10 分間ボルテックスした後、各チューブを 1500 r/min で 15 分間遠心分離しました。 各チューブ内のメタノール層から合計 2 ml の液体を取り出し、5 ml の凍結保存チューブに入れた。 メタノールを強制空気下で乾燥除去し、残りをホルモンアッセイに使用した。
市販の酵素免疫測定キット（Rat Testosterone Elisa Kit、Fanying Biotechnology Co., Ltd.（中国、上海）製）を使用してテストステロンアッセイを実行しました。 このキットの感度は 1.0 ナノモル/l、他のステロイド (プロゲスチン、コルチコイド、エストロゲンを含む) に対する交差反応性は 1% 未満です。 テストステロンレベルは、乾燥糞便1グラムあたりの糞便テストステロンのナノグラムとして報告されました。
統計分析
すべての統計作業は R プラットフォーム 4.2.2 で実行しました。 [36]。 まず、実験的治療が S. dauricus の糞便テストステロン レベルに影響を与えるかどうかをテストするために、対応のあるサンプル t 検定を採用しました。 Rパッケージ「lme4」を使用して、再捕獲された個体に記録されたティック負荷（以下、TickLoadafter）に関する負の二項一般化線形混合効果モデル（GLMM）を構築しました。 [37] および「lmerTest」 [38]。 固定用語には、治療（対照群または治療群）、性別（男性または女性）、体重（2回の測定値の平均値）、外部寄生虫チェックの最初のラウンドで記録されたダニ数（すなわち、テストステロン操作前のダニ数、以下、TickLoadbefore）、外部寄生虫チェックの第 2 ラウンドにおけるノミの量（以下、FleaLoadafter）、および治療とセックスの間の相互作用用語。 サイト ID はランダムな用語として使用されました。 同様のモデルは、治療、性別、体重、外部寄生虫チェックの第 1 ラウンドで記録されたノミの量 (以下、FleaLoadbefore)、TickLoadafter、および治療と性別の相互作用を含む固定因子を使用して、FleaLoadafter についても構築されました。 分散インフレ係数 (VIF) は、R パッケージ「car」を使用して計算されました。 [39] 多重共線性を評価します。 VIF はすべて 10 未満であったため (表 1)、モデル内のすべての要素を保持しました。 モデルの選択は、サンプルサイズが小さい場合に補正された Alkaike 情報量基準 (AICc) に基づいて実行されました。 [40] Rパッケージ「MuMIn」を使用 [41]。 上位の候補モデル間でパフォーマンスに大きな差がなかったため (つまり、デルタ AICc が 2 より小さい)、条件付きモデルの平均化を使用して、候補モデルの完全なセットに基づいて「平均モデル」を取得しました。 [40]。 TickLoadafter で治療と性別の間に有意な相互作用効果が検出されたため、オスとメスのリス用に TickLoadafter で 2 つの GLMM を個別に構築しました (表 2）。 これら 2 つのモデルの固定用語には、治療、体重、TickLoadbefore、および FleaLoadafter が含まれていました。
表 1 ダウリアンジリス (Spermophilus dauricus) の外部寄生虫負荷 (データセット全体) に関する負の二項一般化線形混合効果モデルに基づく条件付きモデルの平均化の結果 表 2 負の二項一般化線形混合効果に基づく条件付きモデルの平均化の結果オスまたはメスのダウリアンジリス (Spermophilus dauricus) のダニ負荷に対する影響モデル
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2024-03-30 10:58:50