細胞
Madin-Darby イヌ腎臓 (MDCK) 細胞は、5% 新生子牛血清 (NCS) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地 (MEM) で維持されました。ヒト胎児腎臓 293 T 細胞を、10% ウシ胎児血清 (FBS) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 中で培養しました。 Lenti-X 293 T 細胞は、10% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した DMEM 中で維持されました。 MDCK-SIAT1 細胞は、1 mg/ml G418 ジェネティシン、10% FBS、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した DMEM 中で維持されました。
ウイルス
H5N1ウイルス [A/chicken/Ghana/AVL-76321VIR7050-39/2021 (H5N1; clade 2.3.4.4b), and A/India/SARI-4571/2021 (H5N1; clade 2.3.2.1a)] GISAID の配列に基づいて pHH21 プラスミドにクローン化された合成遺伝子フラグメントを使用して、リバース ジェネティクス 11 によって生成され、0.3% ウシ血清アルブミン (BSA) および 0.5 μg/mL を含む MEM 中の MDCK 細胞で増殖されました。 NP-トシル-L-フェニルアラニン クロロメチル ケトン (TPCK) 処理トリプシン。高病原性鳥インフルエンザウイルスを使った実験は、日本の東京大学にある強化されたバイオセーフティレベル3（BSL3）封じ込め実験室で行われ、日本の農林水産省によってそのような使用が承認されています。
偽型ウイルス
A/chicken/Ghana/AVL-76321VIR7050-39/2021 株由来の HA および NA タンパク質を有するシュードタイプ ウイルスは、4 つのプラスミド、pCAG-H5HA および pCAG-N1NA を同時トランスフェクションすることにより Lenti-X 293 T 細胞で生成されました。それぞれ、H5-HA タンパク質と N1-NA タンパク質のコード配列。 HIV の gag および env 遺伝子を運ぶレンチウイルス骨格プラスミド pCI-neo synHIVgp-RRE。 pGreenFire Transcriptional Reporter Lentivector は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) とホタル ルシフェラーゼ レポーターを発現します。偽型 H5N1 ウイルスを含む上清をトランスフェクションの 48 時間後に収集し、濾過しました。偽型ウイルスの TCID50 値は、MDCK-SIAT1 細胞においてルシフェラーゼ レポーター活性を測定することによって決定されました。
DS8390の準備
動物実験
マウスを使った実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に従って実行されました。本プロトコールは東京大学医科学研究所動物実験委員会動物実験委員会により承認された（承認番号：PA20-06）。ウイルス接種はイソフルランによる麻酔下で行われ、ウイルス感染後の苦痛を最小限に抑えるために、動物はイソフルランによる深い麻酔下で頚椎脱臼により人道的に安楽死させられた。
マウスの免疫化
BALB/c マウス (7 週齢メス、日本エスエルシー株式会社より入手) をイソフルランで麻酔し、ビヒクル緩衝液で筋肉内疑似免疫した。 [10 mM histidine, 300 mM sucrose (pH 7.0)] または、免疫原性分析およびウイルス攻撃研究のために、20μL中の1μgまたは10μgのDS8390を免疫の間に2週間の間隔を置いて2回免疫しました。
免疫化マウスの免疫原性分析
体液性免疫および T 細胞応答の分析では、DS8390 による 2 回目の免疫の 2 週間後に免疫マウスをイソフルランで麻酔し、深部麻酔下で心臓穿刺によって血液を採取しました。頚椎脱臼による安楽死後、脾臓を採取して単細胞懸濁液を調製した。
微量中和アッセイ
H5 インフルエンザウイルスに対するウイルス中和抗体力価を血清サンプルで評価しました。血清サンプルを受容体破壊酵素 (RDE; Denka seiken) で 37 °C で 20 時間処理し、56 °C で 1 時間不活化して、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1:10 に希釈しました。血清の 2 倍段階希釈液を MEM で調製し、各希釈液を 1 μg/mL の TPCK-トリプシンを含む MEM 中で同量のウイルス希釈液 (100 TCID50/50 μL) とともに室温で 1 時間インキュベートしました。血清/ウイルス混合物を、前日に96ウェルプレートに播種した100%コンフルエントのMDCK細胞に添加した。細胞を 37 °C で 3 日間インキュベートし、細胞変性効果 (CPE) を目で顕微鏡で評価しました。ウイルス中和力価は、CPEを完全に防止する最高の血清希釈の逆数として決定されました。各サンプルを二連で幾何平均力価について分析した。
シュードタイプウイルス中和アッセイ
H5 インフルエンザウイルス由来の HA および NA タンパク質を有するシュードタイプウイルスに対する血清中和活性を評価しました。血清を受容体破壊酵素 (RDE; Denka seiken) で 37 °C で 18 ～ 20 時間処理し、56 °C で 30 分間不活化して、OPTI/MEM で 1:10 に希釈しました。血清の 2 倍段階希釈液を OPTI/MEM で調製し、各希釈液を同量のウイルス希釈液 (100 TCID50/50 μL) とともに OPTI/MEM 中で 37 °C で 30 分間インキュベートしました。血清/ウイルス混合物を、前日に96ウェルプレートに播種した100%コンフルエントのMDCK-SIAT1細胞に添加した。細胞を37℃で2日間インキュベートし、その後、Bright-Glo ルシフェラーゼ検出システム（Promega）を使用してルシフェラーゼ活性を測定しました。発光シグナルは、プレートリーダー(BMG Labtech)を使用して測定した。ウイルスが感染していないと判定するカットオフ値は陰性対照ウェルの値に基づいて設定し、ウイルス中和力価は完全に感染を阻止する最高の血清希釈の逆数として決定した。各サンプルを二連で幾何平均力価について分析した。
組換えタンパク質の発現と精製
A/ニワトリ/ガーナ/AVL-76321VIR7050-39/2021またはA/インド/SARI-4571/2021の可溶型組換えHA（rHA）の発現プラスミドを構築するには、HAシグナルペプチドと細胞外ドメイン（アミノ酸残基HA1- 1-HA2-176）、ジスルフィド結合（HA1-M30C および HA2-K51C）を形成する安定化変異と解毒された切断部位（KRRKR/G が A/G に置換されている; スラッシュは切断部位を示す）を持ち、その後に T4 が続きます。フォールドン三量体化ドメインと C 末端のヘキサヒスチジンタグを pCAGGS プラスミドにクローニングしました。タンパク質をExpi293F細胞（Thermo Fisher Scientific）で発現させ、TALON金属アフィニティー樹脂（TaKaRa Clontech）を使用して精製しました。
酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)
ELISA はマウス血清の rHA を使用して実行されました。 ELISAプレートを、PBS中2μg/mlの濃度の抗原タンパク質50μlで4℃で一晩コーティングした。 1% BSAを含むPBSでブロッキングした後、プレートを、0.5% BSAおよび0.05% Tween 20を含むPBSで5倍連続希釈した熱不活化（56℃で30分間）血清と3回インキュベートしました（PBS-BT） ）。室温で 1 時間インキュベートした後、プレートを 0.1% Tween 20 を含む PBS (PBS-T) で 4 回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼと結合した抗マウス IgG (H + L) 二次抗体 (1: PBS-BT で 20,000 倍希釈)、室温で 1 時間。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで４回洗浄し、１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で展開した。 10分間のインキュベーション後、1N硫酸を添加して反応を停止した。吸光度を450nmの波長で直ちに測定した。
酵素結合免疫スポット (ELISpot) アッセイ
PVDF 膜 (Millipore) を備えたマルチスクリーン 96 ウェル プレートを抗マウス IFN-γ 捕捉抗体で 4 °C で一晩コーティングし、10% FCS を含む RPMI 1640 培地で 2 時間ブロックしました。脾臓から単細胞懸濁液を調製するために、各マウスの脾臓を個別に 2 ～ 3 mm の小片に切り、ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 中でコラゲナーゼ D とともに 37 °C で 30 分間インキュベートし、70 ℃ の平衡塩類上で穏やかにすりつぶしました。 -μmセルストレーナー(BD Falcon)。解離した細胞を遠心分離し、1X RBC 溶解バッファー (eBioscience) で 2 分間処理し、HBSS で洗浄しました。次に細胞を、10% FCS、1X MEM 非必須アミノ酸溶液 (Gibco)、1 mM ピルビン酸ナトリウム (Gibco)、および 0.05 mM 2-メルカプトエタノールを含む RPMI 1640 に再懸濁しました。生細胞数はトリパンブルー染色を使用して決定されました。次に、各動物からの 2 × 105 生細胞/ウェルを、120 μL の RPMI 培地中の 3 μg の同種 ch/ガーナ rHA または異種インド/S4571 rHA タンパク質とともにプレコートされたアッセイプレートに播種し、37 °C で培養しました。 3日間。次いで、プレートを水で洗浄し、製造業者の指示に従ってマウスIFN-ガンマELISpotキット(BD)を使用してスポットを染色するように処理した。染色スポットは、ImmunoSpot アナライザー (CTL) を使用してカウントされました。
免疫化マウスのウイルス攻撃
ウイルス攻撃研究のために、２回目の免疫の２週間後にイソフルランによる麻酔下で顎下静脈を介して免疫動物から血液を採取した。 2回目の免疫化の3週間後に、マウスに10マウス致死量中央値（MLD50）のA/ニワトリ/ガーナ/AVL-76321VIR7050-39/2021（H5N1;クレード2.3.4.4b）またはA/インドを鼻腔内感染させた。 /SARI-4571/2021 (H5N1; クレード 2.3.2.1a)。体重と生存率を 14 日間毎日監視しました。 25%を超える体重減少または神経症状のあるマウスは、イソフルランによる深い麻酔下で頚椎脱臼により安楽死させた。
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