ダニ
フィールドサンプル R。 マイクロプラス ブラジル、リオグランデ・ド・スル州の6つの異なる牧場からのお腹が膨れた雌マダニが、農家らによってInstituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor（Eldorado do Sul、ブラジル）の寄生虫学研究室に提出された。または獣医師。これらの申請は、州の殺ダニ剤耐性監視プログラムの一環であり、耐性レベルを監視するための臨床検査の実施が含まれる。畜産農家と獣医師はFAOの勧告に従ってマダニを送るよう指示された [11]。各サンプルには、5 ～ 10 頭の動物から収集された約 200 匹のダニが含まれており、それぞれの農場の牛から収集後 48 時間以内に受け取られました。
ダニの準備
ダニの処理手順はFAOが推奨するガイドラインに従った [11]。到着後、マダニを水で洗い、ペーパータオルで乾燥させ、サイズ（> 8.0 mm）、損傷の有無、および活力に基づいて選択しました。選択されたダニは、バイオアッセイでさらに処理するためにペトリ皿 (直径 15 cm、深さ 2 cm) に置かれました。各サンプルからの 90 ダニのグループが AIT で直接使用されました。さらに、同じサンプルから採取した充血した雌ダニ 30 匹をペトリ皿 (90 mm × 10 mm) に移し、27 ± 1 °C、相対湿度 80 ～ 90% に設定した環境チャンバー内で 14 日間、卵を産ませるために培養しました。敷設。産卵後、卵をプールし、幼虫の孵化を可能にするために同じ条件下で綿栓で密封した5 ml血清バイアル中でインキュベートした。その後、生後 14 ～ 28 日の幼虫を RIT に使用しました。
成人イマージョンテスト (AIT)
成ダニに対する殺ダニ活性を評価するために、Drummond et al. が記載した成体浸漬試験 (AIT) プロトコルに従いました。 [14]わずかな変更を加えて。殺ダニ剤溶液は、噴霧による牛の治療に関するラベルの推奨に従って製品を希釈することによって調製されました。調製物は以下の通りであった：（i）1:1000希釈のデルタメトリン（Butox® P CE25、MSD Saúde Animal、サンパウロ、ブラジル）（最終濃度：25 mg/ml）、および（ii）シペルメトリン、クロルピリホスの組み合わせ、およびピペロニルブトキシド（Cyperclor Plus®、Ceva Saúde Animal Ltda、パウリニア、ブラジル）を1:800に希釈したもの（最終濃度：それぞれ18.75 mg/ml、31.25 mg/ml、および18.75 mg/ml）。均質性を確保するために体重別に分類した、10 匹のお腹を満たした雌ダニのグループを、100 ml の殺ダニ剤溶液に 5 分間浸漬しました。対照群も同様に処理しましたが、蒸留水に浸漬しました。浸漬後、金属ふるいを使用してダニから水を切り、ペーパータオルで水分を拭き取り、プラスチックペトリ皿（90 mm × 10 mm）に置きました。次に、これらの皿を 27 ± 1 °C、相対湿度 80 ～ 90% に設定した環境チャンバー内で 14 日間インキュベートし、産卵させました。次に、各皿からの卵の重さを量り、綿栓で密封した 10 mL ガラス分析チューブに移し、同じ条件下で 4 週間インキュベートして幼虫を孵化させました。この期間の後、幼虫の孵化率を実体顕微鏡を使用して視覚的に推定し、全卵質量に対する空の卵の割合を比較しました。一貫性を確保するために、同じオペレーターがすべての評価を実行しました。実験は、殺ダニ処理群および対照群ごとに、新たに調製した溶液に曝露した10匹の雌ダニからなる3つの独立した群を用いて、三重に実施した。
抵抗強度試験 (RIT)
耐性強度試験は、市販のデルタメトリン (Vectocid®) と Vectoclor® (シペルメトリン、クロルピリホス、ピペロニル ブトキシド (PBO) (Ceva Animal Health) の推奨濃度に加え、5 倍および 10 倍の高濃度を組み合わせたものを使用して準備されました。デルタメトリンの濃度は、1 ×、5 ×、および 10 × 濃縮用量でそれぞれ 0.25 mg/ml、1.25 mg/ml、および 2.5 mg/ml でした。併用製品中のシペルメトリンの濃度は、1 ×、5 ×、および 10 × 濃縮用量でそれぞれ 0.56 mg/ml、2.8 mg/ml、および 5.5 mg/ml でした。併用製品中のクロルピリホスの濃度は、1 ×、5 ×、および 10 × 濃縮用量でそれぞれ 0.94 mg/ml、4.69 mg/ml、および 9.94 mg/ml でした。 AIT と RIT に同じ製品が使用されていないのは、両方のテストが異なる研究室で使用されているプロトコルに従って開発されたためです。デルタメトリンの賦形剤は異なりますが、組み合わせた製品は同じでした。希釈液はアセトン/オリーブ油 (2:1) の混合物で作成し、続いて 0.9 ml を 10 × 7 cm の Whatman (no.1) 品質濾紙 (Merck Life Science、アムステルダム) に 3 回含浸させました。濾紙を換気フード内のアルミニウムトレイ内で少なくとも60分間完全に乾燥させた。その後、ろ紙を濃度ごとにグループ分けし、ビニール袋に密封し、使用するまで室温の暗所に保管しました。
各農場から収集された充血した雌からの幼虫子孫は、RIT で利用されました。試験中、各濾紙を半分の幅に折り畳んでパケットを作成し、ブルドッグクリップで密封した。防ダニ作業ステーションは、1% の洗浄/消毒液を含む水で内張りし、追加のバリアとして端の周りに両面テープを固定することによって準備されました。約１００匹の幼虫を、細いブラシを使用して飼育バイアルから各パケットに慎重に移した。最初に対照パケットをロードし、次に 1 × および 5 × パケット、最後に最高濃度の殺ダニ剤を含むパケットをロードしました。密封された幼虫パケットは、27 ± 1 ℃、相対湿度 80 ～ 90% に設定された環境チャンバー内で培養されました。 24 時間後、各パケットを開封し、対照群から始めて最高濃度まで生きている幼虫と死んだ幼虫の数を記録しました。麻痺した幼虫、または歩く能力がなく脚のみの動きを示した幼虫は死亡したとみなされました。死亡率の基準は、パケットを開いた後に穏やかに呼吸することによるCO2刺激後に幼虫が歩くことができなくなることであった。合計で、それぞれ異なる濃度の殺ダニ剤を含浸させた 3 つのパケットと、対照パケットをそれぞれの圃場分離株に対して準備しました。
テストの読み取りと統計分析
AITでは、各処理群について次のパラメータが測定されました：満腹雌の体重、卵塊重量および幼虫孵化率。インビトロ有効性は、Drummond et al.に従って計算されました。以下の方程式を使用します。 (1) 受胎能指数 (IF) = (卵の質量/満腹した雌の体重) × 幼虫の孵化率。 (2) in vitro 有効性 (%) = 100 × [1 − (IF treated group/ IF control)]。 Microsoft Excelを使用して、各パラメータの平均値と標準偏差を計算しました。分散分析 (ANOVA) に続いて Tukey (p15]。決定表を使用して、ダニが感受性があるか、または低、中、高の抵抗レベルを持っているかどうかを決定しました (表 1)。 1 × 推奨濃度の RIT に曝露された幼虫の死亡率と AIT で得られた in vitro 有効性は、VassarStats (http://vassarstats.net/index.html）。
表 1 耐性強度試験 (RIT) でさまざまな濃度の殺ダニ剤に曝露されたダニの耐性レベルを決定するための決定表
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2024-11-20 20:37:00