動物
KOR を標的とした CRISPR/Cas9 の設計と in vivo トランスフェクション
KOR を削除するために、すべての KOR スプライス バリアントに共通する oprk1 の 2 番目のエクソン (ENSMUSG00000025905、gRNA: gTCCCCCATTCAGATCTTCCG、オンスコア 65.7、オフスコア 78.8) をターゲットにしました。示された gRNA 配列は、前述のように、pL-CRISPR.EFS.tRFP レンチプラスミド (カタログ番号 57819、Addgene、ウォータータウン、マサチューセッツ州、米国) の Esp3I 制限部位に挿入されました。 [7]。プラスミドはサンガー配列決定法（Eurofins、ルイビル、ケンタッキー州、米国）によって検証されました。
頭蓋内アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターまたは KOR CRISPR プラスミドマイクロインジェクション
hM4Di-mCherry または KOR CRISPR プラスミド (500 nL) をコードする AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry (150 nL; ウイルス プレップ #44362-AAV8、Addgene、マサチューセッツ州ウォータータウン、米国) を ACC に両側から注入しました (ブレグマに対して前方 1.41 mm、側方 0.25 mm、腹側 0.8 mm）。実験は、AAV注射の少なくとも4週間後、またはプラスミド注射の1週間後に実施されました。 hM4D(Gi)-mCherry 発現を事後検証しました。
部分坐骨神経結紮手術
EEG/EMGヘッドマウント手術
EEG/EMGの記録と分析
マウスは、専用の静かな部屋に割り当てられた透明なプレキシガラス製睡眠室 (直径 241 mm) に個別に配置され、少なくとも 3 日間実験条件に順応させました。 EEG と EMG は、低トルクの整流子を備えたプリアンプとケーブルを介して記録されたため、マウスは自由に動けるようになりました。データは、Sirenia ソフトウェア (Pinnacle Technology) を使用して収集されました。すべてのデータは、前頭葉に配置されたEEG電極から取得されました。データは、SleepSign ソフトウェア (キッセイコムテック、長野県松本市) により盲検法で分析されました。 5 秒ごとの警戒状態は、覚醒、急速眼球運動 (REM)、またはノンレム (NREM) 睡眠に自動的に分類されました。覚醒状態は、高いEMG振幅と低いEEG振幅によって定義されました。レム睡眠は、低い EMG 振幅、低い EEG 振幅、および高いシータ (θ) 波 (5.0 ～ 10.0 Hz) 活動によって定義されました。ノンレム睡眠は、低いEMG振幅、高いEEG振幅、および高いデルタ（δ）波（0.65〜4.5 Hz）活動によって定義されました。 [7]。最終ステップとして、定義された睡眠覚醒段階を視覚的に検査し、必要に応じて修正しました。
フォン・フライのテスト
条件付き場所優先 (CPP) と条件付き場所回避 (CPA)
5日間のコンディショニングプロトコルを使用して、進行中の痛み（CPP）と痛みの回避（CPA）を評価しました。 [7] 図S1に示すように。順応日（１日目）に、マウスをＣＰＰ／ＣＰＡボックス（Panlab、Harvard Apparatus – LE896/76-0376およびLE989/76-0441）に15分間入れ、すべてのチャンバーに自由にアクセスさせた。翌日、マウスを再度チャンバーに入れ、各チャンバーで費やしたベースライン（プレコンディショニング）時間を自動ソフトウェア（Panlab、Harvard Apparatus – PPCWIN）を使用して 15 分間分析しました。次の 2 つの条件付け日 (3 日目および 4 日) では、マウスは午前中に生理食塩水注射 (ip) を受け、1 つの条件付けチャンバーに 30 分間閉じ込められました。 4時間後、マウスにCPPの場合はガバペンチン(30mg/kg、腹腔内)、またはCPAの場合はCNO(5mg/kg、腹腔内)を投与し、反対側のチャンバーに30分間入れた。チャンバーの割り当ては相殺されました。試験日（ポストコンディショニング、5 日目）、マウスを CPP/CPA ボックスに入れ、すべてのチャンバーを 15 分間自由に探索させました。チャンバー内の時間を記録して、チャンバーの好みを決定しました。 CPP 差スコアは、薬物ペアのチャンバーでのテスト時間 – 薬物ペアのチャンバーでのベースライン時間として計算されました。 CPAスコアは、テスト時間（ベースライン）におけるCNO対チャンバーと生理食塩水対チャンバー間の時間差として計算されました。
hM4D(Gi)-mCherry発現の検証
麻酔をかけた動物に、露出した心臓の左心室から 4% パラホルムアルデヒドを灌流しました。脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドで４時間後固定し、各溶液中で１５％および３０％スクロースで２４時間脱水した。脳を厚さ20μmで冠状に切片化し、DAPI染色した。 mCherry の発現を評価するために、切片サンプルを検査し、Echo RVL-100-M 顕微鏡 (米国カリフォルニア州サンディエゴ) で写真撮影しました。 [7]。 hM4D(Gi)-mCherryの両側性ACC発現を示さなかった動物は研究から除外された。
KORのCRISPR/Cas9編集の検証
KOR CRISPR/Cas9 が標的の脳領域における KOR 発現を効果的に減少させたことを検証するために、ウェスタンブロッティングを使用して ACC 脳パンチにおける KOR 発現を定量しました。動物を安楽死させ、脳を迅速に解剖し、脳マトリックスを使用して、ACCを含むブレグマの約1.4mm前方の2mmの冠状切片を氷上で切断した。 ACC の 2 mm パンチを収集し、液体窒素中で凍結しました。組織を、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、およびベンゾナーゼを含む溶解緩衝液でホモジナイズした。抽出されたタンパク質を電気泳動によって分離し、PVDF 膜 0.45 μm (Millipore、ダルムシュタット、ドイツ) に転写しました。膜をTBST (50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% Tween 20、pH 7.4)、5% 脱脂粉乳でブロックし、ウサギ抗KOR 抗体 (カタログ番号 sc-9112、 Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）およびマウス抗βIII-チューブリン抗体（カタログ番号 G7121、Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を含む TBST、5% ウシ血清アルブミン。ブロットをAlexa Fluor 555抗ウサギおよびAlexa Fluor 647抗マウス二次抗体中でインキュベートし、Odyssey Fc Imager（LI-COR、リンカーン、ネブラスカ州、米国）によって蛍光を検出しました。
統計分析
データは正規分布に従い、Student によって分析されました。 t 検定または二元配置反復測定分散分析とそれに続く Tukey 検定または Sidak 検定。統計分析は、GraphPad Prism 10 を使用して実行されました。データは平均値 ± SEM として表示され、統計的有意性は次のように設定されました。 P1.
#皮質カッパオピオイド受容体はマイナスの感情と睡眠障害を統合します