動物
すべての動物実験は北京生物製品研究所の動物実験委員会によって承認されました。実験には生後3～4週の雄マウスを使用しました。
2BS細胞培養
ヒト二倍体細胞株 2BS は、中絶された 3 か月齢の胎児の肺組織から採取され、1974 年に樹立されました。この細胞株はライフサイクルが長く、66 世代にわたって継代することができます。2BS 細胞は、10% ウシ胎児血清 (FBS) (HyClone、米国) を添加した DMEM で 6 ～ 8 日間培養されました。その後、細胞を消化し、継代しました。継代細胞は狂犬病ウイルスの培養に使用されました。
ウェスタンブロット分析
氷冷した RIPA 溶解緩衝液を使用して狂犬病ウイルスサンプルからタンパク質を抽出しました。サンプルの総タンパク質濃度は BCA アッセイ (Pierce、米国) で測定しました。次に、タンパク質を SDS-PAGE ゲルで分離し、クマシーブリリアントブルーで染色するか、PVDF メンブレン (Merck Millipore、ドイツ) に転写しました。メンブレンを 3% w/v ウシ血清アルブミンで 1 時間ブロックし、次に狂犬病ウイルス G タンパク質に対する一次抗体 (HyTest 3R7-4F1、中国) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。1× TBST で洗浄した後、メンブレンを適切な二次西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ IgG 抗体 (Biodragon、中国) とともにインキュベートしました。 免疫ブロットは増強化学発光 (ECL) 試薬で可視化し、ChemiDoc XRS + 装置 (Bio-Rad、米国カリフォルニア州ヘラクレス) を使用して評価しました。
クマシーブライトブルー染色
タンパク質を含むSDS-PAGEゲルをタンパク質染色装置（eStain LI、Genscript）に入れ、クマシーブルーで2分間染色するサイクルを1回、脱色液で2.5分間溶出するサイクルを2回繰り返した。
シーケンシング
ヌクレオチド配列決定は、allwegene Beijing（北京、中国）によって実施されました。ゲノムRNAは、異なる継代数のウイルスから抽出され、核酸濃度はQubit機器によって測定されました。ライブラリ構築には、VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3を使用しました。ライブラリは、NextSeq550機器（Illumina、米国）で配列決定され、品質管理後にクリーンリードが得られ、bwaソフトウェア（v0.7.17-r1198-dirty）を使用して参照ゲノム（aG株（GQ412744.1））との詳細な比較分析が行われ、比較率とカバレッジが計算されました。
酵素免疫測定法（ELISA）
抗原レベルはELISAで評価した。抗aG株抗体をマウス血清から抽出し、ELISAプレートのコーティングに使用した。抗aG株抗体を96ウェルプレートに加え、37℃で1～2時間インキュベートした後、4℃で一晩インキュベートした。翌日、96ウェルプレートを3% BSAで37℃で1時間ブロックした。続いて、細胞を加えて1時間培養した。酵素標識抗体を37℃で30分間インキュベートした後、TMB one溶液と停止溶液を順次加えた。各ウェルの吸光度（OD値）をマイクロプレートリーダーで450 nmと630 nmの波長で測定し、最終OD値は450 nmの吸光度値から630 nmの吸光度値を差し引いて決定した。
ウイルスプラークの形成
2BS細胞を6ウェルプレートに播種し、同時に2BS細胞に順応した狂犬病ウイルスを添加した。その後、2BS細胞と狂犬病ウイルスを37℃、5% CO2のインキュベーターで一晩共培養した。翌日、培養液を捨て、0.5%メチルセルロースを添加し、狂犬病ウイルスに感染した2BS細胞をさらに6日間培養した。6ウェルプレート上で細胞変性または疑わしい病変が見られた場合、病変部位を選択した。選択したプラークを2BS細胞懸濁液の入った96ウェルプレートに入れ、37℃、5% CO2のインキュベーターで6日間培養した。その後、上清を採取し、2BS細胞懸濁液の入った24ウェルプレートに移した。6日間培養した後、上清を採取し、抗原含有量を検出した。 抗原含有量の高いウイルスは、2BS 細胞でさらに培養するために選択されました。抗原含有量の高い狂犬病ウイルスを 2BS 細胞に適応させて 3 世代後にウイルス力価を検出し、最も力価の高いウイルスをさらに培養するために選択しました。
質量分析
狂犬病ウイルスサンプルからタンパク質を抽出し、界面活性剤 RapigestTM SF (Waters Corporation、米国) で処理してタンパク質構造を破壊しました。次に、DTT (EMD Millipore Corporation、米国) でジスルフィド結合を開き、IAM (EMD Millipore Corporation、米国) でブロッキングしました。最後にタンパク質をトリプシンで消化し、ギ酸で反応を停止しました。ペプチドの分離は Acquity Pertide BeyC18 カラム (Waters Corporation、米国) で行い、サンプルは Thermo Scientific Q Exactive Plus 質量分析計で収集しました。収集したデータは BioPharma Finder ソフトウェアで分析しました。バイアスが低い (Delta ≤ 5 ppm)、信頼スコアが 100、親イオンと娘イオンの両方が検出されたサンプルを比較しました。
直接蛍光抗体検査
2aG4-B40 の狂犬病抗原を同定するために、直接蛍光抗体検査が使用されました。BHK-21 細胞を 96 ウェル プレートに播種し、単層を形成させました。次に、細胞をウイルス (5 倍希釈系列) に 37 °C で 24 時間感染させました。次に、細胞を 80% 氷冷アセトンで固定し、イソチオシアネート FITC 標識 N タンパク質で染色しました。プレートは蛍光顕微鏡で観察されました。
ウイルス滴定
ウイルス力価は、中国薬局方に記載されているように、マウスの脳内注射によって測定されました。簡単に説明すると、体重 11 ～ 13 g の異なるグループの NIH マウス (各グループ 6 匹) の脳に、ウイルスの連続 10 倍希釈液 0.03 ml を接種し、接種後 3 日以内に発生した非特異的死亡を除外しました。臨床症状を発症して死亡したマウスの数は、14 日後に記録されました。半数致死量 (LD50) とウイルス力価は、リードとミュンヒの方法を使用して計算されました。
狂犬病ウイルスの特定
2aG4-B40株の特異的性質は、マウスの脳内中和試験によって同定された。ウイルスは10倍ずつ段階的に希釈され、適切な希釈度のウイルスが狂犬病免疫グロブリン（中和群）または陰性血清（対照群）と等量混合された。体重11～13gのNIHマウス群（各群6匹）に、各希釈度の混合物を0.03mlずつ脳内接種し、接種後3日以内の非特異的死亡を除外した。臨床症状を発現し死亡したマウスの数は、14日後に記録された。半数致死量（LD50）およびウイルス力価は、リードおよびミュンヒ法を使用して計算された。中和指数は、対照ウイルス力価から中和ウイルス力価を引いた値の逆数である。
試験ワクチンの準備
採取した 2aG4-B40 株は、まず 300 kDa 限外濾過膜 (Millipore Pellicon 2、米国) で濃縮し、次にクロマトグラフィーカラムで精製しました。精製したウイルスは β-プロパノラクトンで不活化しました。次に、精製したウイルスを抗原濃度 200 mIU/mL で使用して試験ワクチンを調製しました。試験ワクチンは、真空凍結乾燥機 (上海協和真空工学株式会社) で適切な保護剤とともに凍結乾燥されました。凍結乾燥プロセスは、-40 °C での凍結、-3 °C での一次乾燥、28 °C での二次乾燥の 3 段階から構成されています。
免疫原性研究
暴露前予防（PrEP）および暴露後予防（PEP）ワクチン接種は狂犬病を予防する効果的な手段です。そのため、試験ワクチンの免疫原性はPrEPおよびPEPワクチン接種によって決定されました。
PrEP ワクチン接種レジメンは、D0 および D7 に腹腔内注射で投与されました。具体的には、NIH マウス (12～14 g) に 0.5 ml の試験ワクチンを 0 日目と 7 日目に注射しました。陰性対照マウスには、同様に 0.5 ml の PBS を注射しました。両グループのマウスには、14 日目に脳内注射により、標準化ウイルス (CVS 株、0.03 ml、1 回あたり 10 匹のマウス) を連続 10 倍希釈で投与しました。14 日後に臨床症状を発現して死亡したマウスの数を記録しました。半数致死量 (LD50) は、リードおよびミュンヒ法を使用して計算しました。防御指数は、ワクチン群と対照群の LD50 の比として決定しました。
WHOの推奨に従い、5回投与レジメン（エッセン、1-1-1-1-1）はPEP IMレジメンの1つでした。マウスの狂犬病ウイルス中和抗体濃度（RVNA）を測定するために、迅速蛍光フォーカス阻害試験（RFFIT）が行われました。 [24] 0、7、14、28、42日目に採取された血清サンプルを評価するために使用されました。
ワクチン効力試験
NIH テスト (図) は、マウスにおける感染に対する適応ワクチンの防御効果を評価し、それを国家標準狂犬病ワクチンの防御効果と比較するための検出方法として選択されました。国家標準ワクチンとテストワクチンのさまざまな希釈度が、0 日目と 7 日目に NIH マウス (12～14 g、マウス 1 匹あたり 0.5 ml、1 回あたり 10 匹) に腹腔内注射されました。次に、14 日目にすべてのマウスに標準化ウイルス (CVS 株、0.03 ml) を脳内注射で投与しました。このテストには CVS 株の滴定が不可欠でした。Reed および Muench 法を使用して、平均有効量 (ED50) を計算しました。テストワクチンの相対的な効力は、国家標準の ED50 との比較によって得られました。
統計分析
統計データは平均±SEM（平均の標準誤差）として提示されます。すべての統計分析にはGraphPad Prismバージョン9.0を使用しました。2つのグループを比較するためには、対応のある両側のスチューデントt検定を使用し、2つ以上のグループ間の差異を比較するためには、一元配置分散分析（ANOVA）を使用しました。すべての統計実験は、少なくとも3回独立して繰り返されました。P
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2024-07-08 10:27:27