研究集団とデータ収集
この研究は、西中国第二大学病院の倫理委員会（No. 2015（011））によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って行われました。すべての参加者は、アンケートに記入し、生物学的サンプルを提供する前に、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。この研究で使用されているデータとサンプルはすべて、プロジェクトBiobankから来ました。先天性心臓病の家族歴のないシングルトンは、コントロールと症例を構成しました。
16S RDNA第3世代のフルレングスシーケンス
PACBIOシーケンスプラットフォーム（BioMarker Technologies、北京、中国）を使用して、羊水の豊富さと多様性を定量化しました。生のサブリードは、Min-Passes≥5およびMinpredictedictediccuracy≥0.9（SMRT Linkバージョン8.0）の後、円形コンセンサスシーケンス（CCS）にさらされました。その後、LIMAバージョン1.7.0を使用して、1200〜1650 bp CCを高品質のクリーンタグにフィルタリングし、UCHIMEメソッドを使用してキメラシーケンスを識別および排除しました。最終的に、Usearch（バージョン10.0）を使用して、97％の類似性レベルで適格なシーケンスをクラスター化しました。運用分類ユニット（OTU）を作成するために、総シーケンスの0.005％が品質フィルタリングされていると判断されました。 70％信頼レベルでSilvaデータベース（v.123）とRDP分類器を使用して、分類法がOTUに割り当てられました。 QIIME2ソフトウェア（バージョン2020.8）を使用して、存在量カバレッジベースの推定器（ACE）、シャノン、シンプソンインデックスなどのアルファダイバーシティインデックスを計算しました。分散分析（ANOVA）を使用して、グループ間の統計的有意性を確立しました。視覚化のためにbray_curtis距離メトリックと主要な座標分析（PCOA）を使用して、サンプル全体の微生物群集の構造的分散を調べるためにベータ多様性分析を実施しました。 Permanova分析を使用して、グループのBRAY_CURTISと非加重UNIFRAC距離が互いにどのように異なるかを調べました。グループ間の有意差を特定するために、メタ星分析（p4、 p
ターゲットメタボロミクス分析
UPLC Beh Amideカラム（2.1×100 mm、1.7μm、水）を装備したab Sciex exionlc InfinityシリーズUHPLCシステムを使用して、ウルトラ（高）性能液体クロマトグラフィー（UHPLC）分離を実現しました。水中（pH = 9.75）（a）およびアセトニトリル（b）の25 mmol/l l酢酸アンモニウムと25 mmol/l l水酸化物（CNW技術）が移動相を構成しました。分析には溶出勾配が使用されました。列の温度は25°でした。注入容積はそれぞれ2 µL（POS）または2 µL（Neg）であり、オートサンプラー温度は4°でした。 LC/MS調査中に情報依存ベース（IDA）でMS/MSスペクトルを取得する能力があるため、5600質量分析（AB SCIEX）が採用されました。このモードでは、取得ソフトウェア（アナリストTF 1.7、AB Sciex）は、事前に決められた基準に基づいてMS/MSスペクトルのキャプチャを収集し、完全なスキャン調査MSデータを継続的に評価します。強度が100を超える各サイクルで最も強い12の前駆体イオンは、30 eVの衝突エネルギー（CE）でMS/MSに対して選択されました。データ品質の制御も検出フェーズ中に行われ、標準のサンプルと空白のコントロールは、品質管理のために慎重に採用されました。北京、中国のバイオマーカーテクノロジーコーポレーション（https://international.biocloud.net/）UHPLC-QTOF-MS分析を実施しました。 Proteowizardを使用して、質量分析（MS）からMZXML形式にRAWデータ（.WIFF）ファイルを変換しました。ピークデコンボリューション、アライメント、および統合は、RプログラムXCMS（バージョン3.2）が処理されたステップの1つでした。カットオフ値とMinFrac値は、それぞれ0.3と0.5に設定されていました。社内のMS2データベースを使用して、代謝物を識別しました。ソフトウェアSIMCAP14.0（Umetrics、Umea、Sweden）を使用して、メタボロミクスデータを分析しました。これは、監視されていないクラスタリング分析、直交部分最小二乗分析（OPLS-DA）、fold変化（FC）、および差次的にグループ化された主成分分析（PCA）に使用されました。微分代謝産物を確認するために、代謝物の並べ替えと次元の削減が行われました。微分代謝産物とマッピングは、OPLS-DAモデルの投影値（VIP）値、FCの倍数、およびWilcoxon-Mann – Whitneyランク合計テストのP値を使用してスクリーニングされました。 Kegg（京都百科事典の遺伝子とゲノム、 https://www.kegg.jp/）およびHMDB（ヒトメタボロームデータベース、 https://hmdb.ca/）データベースを使用して、微分代謝産物の分類情報に注釈を付けました。注釈付きの微分代謝産物は統計的に描画され、濃縮分析にさらされました。
マルチオミクス分析
Mimosa2 Webベースのプラットフォームを採用して、ペアの微分微生物メタボロームデータセットを要約し、機械的解釈と仮説生成を促進しました。ランクベースの推定方法が適用され、代謝産物レベルをコミュニティ代謝電位（CMP）スコアと比較しました [17]。
統計分析
CHDSに関連する細菌属と代謝物の変動を評価するために、症例対照分析を実施しました。パーソナライズされた特性には、母体の年齢、母体の妊娠ボディマス指数（PPBMI）、妊娠時間、飲酒または喫煙習慣のある、II型糖尿病または泌尿生殖器感染症の歴史、妊娠後の抗生物質の使用、妊娠年齢（28週間未満、または28週間）、および幼児の性別（男性または女性）。定性的データは周波数を使用して説明され、連続変数は平均および標準偏差（SD）として表されました。ケースとコントロールの間のこれらの因子の頻度の違いは、カイ二乗検定またはスチューデントのt検定のいずれかを使用して評価されました。すべての統計分析は、rバージョン4.2.3（R統計コンピューティングの基礎、 http://www.rproject.org）。統計的有意性は、両側のものとして定義されました p
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