化学スクリーニング
細胞培養
HEK 293セルは、American Type Culture Collection（CRL-1573; ATCC、VA、USA）から購入し、A549細胞は韓国細胞株銀行（韓国ソウル）から購入しました。 HEK 293とA549の両方の細胞は、Dulbeccoの修正イーグル媒体（DMEM）（Welgene Inc.、Gyeongsangbuk-do、韓国）に維持され、10％胎児ウシ血清（FBS）（FBS）（Welgene Inc.、Gyeongsangbuk-do、韓国語）、および1％ペニシリン/ストリートマイシン/米国）67,68。細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5％CO2で培養しました。
プラスミド、試薬、抗体
SARS-COV-2 RDRP（プラスミド＃141378）、NSP7（プラスミド＃141373）、およびNSP8（プラスミド＃141374）を含む系統タグ付きプラスミドは、Addgene（MA、USA）から入手しました。ウサギポリクローナル抗スレップエピトープタグ（CAT。No.GTX128061）、ウサギポリクローナル抗GAPDH（Cat。No.GTX100118）、およびヤギポリクロナルIgG-HRP（CAT。No.GTX213110-01）は、Genetex、CA（CA、USA、USA）から購入しました。 Remdesivir（HY-104077）は、MedChemexpress（NJ、USA）から購入しました。 Molnupiravir（EIDD-2801、Cat。No。T8309）、Tenofovir（Cat。No.T1649）、およびSofosbuvir（Cat。No.T6676）は、TargetMol（MA、USA）から入手しました。組換えSARS-COV-2 RDRP His-TAGタンパク質（10686-CV-050）は、R＆D Systems（MN、USA）から供給されました。 SARS-COV-2（2019-NCOV）NSP7再結核タンパク質（40617-VNCE）およびSARS-COV-2 NSP8タンパク質（40618-VNCE）は、Sino Biological（北京、中国）から調達されました。
レポーターベクターの確立
5 ‘および3’末端のNHEIおよびAPAI部位に隣接するリボザイムリボザイム配列で構成される遺伝子コンストラクトが合成され、リボザイムの間にbamhiおよびXhoi部位が挿入されました。さらに、BAMHIおよびECORIサイトを備えたSARS-COV-2の3 ‘UTR、および両端にNOTIおよびXHOIサイトを備えたSARS-COV-2の5’ UTRは、バイオニクス（Seoul、韓国）を介して合成されました。合成されたHDVリボザイムリボザイムは、NHEIとAPAIを使用してサブクローニングを通じてpcDNA3.1ベクターにクローン化されました。その後、FLUC遺伝子は、pcDNA3.1-リボザイムリボザイムの複数のクローニング部位内でECORIおよびNOTIにサブクローニングされました。 BAMHIおよびECORI部位を備えた3 ‘UTRおよびNOTIおよびXHOI部位を備えた5’ UTRは、PCDNA3.1-リボザイムフルックリボジームプラスミドのそれぞれの酵素部位にクローニングされました。この最後の構築されたレポータープラスミドには、PCDNA3.1ベクターのCMVプロモーターの制御下で、順番および逆方向に3 ‘UTR、FLUC、および5’ UTR遺伝子が含まれていました。
HEK 293およびA549細胞の細胞生存率
Zファクターの計算によるルシフェラーゼレポーターアッセイ
Zファクターを計算するための式は次のとおりです。 [3(SDNegative + SDPositive)/|meanNegative − meanPositive|]、ここで、SDは標準偏差を表します32。ルシフェラーゼアッセイはで行われました nグループごとに30。
細胞溶解物の調製と免疫ブロッティング
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）ですすぎ、150 mM NaCl、20 mM Tris（ヒドロキシメチル）塩酸アミノメタン（Tris-H.0）、0.5％トリトンX-100、1 MMエテレナティアティア酸）、0.5％トリトンX-100（Tris-Hcl; pH 8.0）、1 MMエテレナ科フェニルメチルスルホニルフッ化物、10 mM NAF、および1 mM Na3vo4。溶解物を4°Cで13,000 rpmで15分間遠心分離し、上清を新しいチューブに慎重に移しました。
製造元の指示に従って、Bradford Protein Assay（Bio-Rad、CA、USA）を使用して、タンパク質の定量化を実施しました。溶解物は、250 mM Tris-HCl（pH 6.8）、50％グリセロール、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、5％β-メルカプトエタノール、および0.01％ブロモフェノールブルーを含む5×サンプルバッファーと混合しました。サンプルを100°Cで5分間沸騰させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ページ、ニトロセルロース膜（GE Healthcare、Wi、USA）に分離しました。一次抗体は、1×TBSTで3回洗浄した後、5％ウシ血清アルブミン（BSA）を希釈しました。タンパク質レベルは、LabWorksソフトウェア（UVP Inc.、CA、USA）を使用してキャプチャおよび分析されました。
プライマー：テンプレートRNAデュプレックスアニーリングおよびプライマー拡張ポリメラーゼアッセイ
プライマー（5ʹ-[Cyanine5] gcuaugugagauuaagaauu-3ʹ）およびテンプレート（5ʹ-uuuuuuuuuuuuuauucuuauauaucaCaugc-3ʹ）は、バイオニア（韓国）によって合成されました。両方を蒸留水に溶解して、100 µmの最終濃度にしました。プライマーとテンプレートは、10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、25 mM NaCl、および2.5 mM EDTAを含むアニーリングバッファーで1：1.5のモル比でアニールされました。このアニーリングプロセスは、95°Cで10分間行われ、その後数時間にわたって室温まで徐々に冷却されました。
プライマー拡張アッセイでは、組換えSARS-COV-2 RDRP His-TAGタンパク質、SARS-COV-2（2019-NCOV）NSP7逆性タンパク質、およびSARS-COV-2 NSP8タンパク質を使用しました。活性SARS-COV-2 RDRP複合体は、室温で30分間、NSP7およびNSP8を等モル濃度（50 µM）でインキュベートすることにより形成されました。次に、RDRPと追加のNSP8を加えて、RDRP：NSP7：NSP8の最終的な複雑な組成を1：3：3の比率で、0.5 µMのRDRPを実現しました。プライマー拡張ポリメラーゼアッセイの場合、この複合体は、アニールされたプライマーテンプレートおよびさまざまな濃度のMEPT-SN-PMEと組み合わされました。反応は、Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM KCl、1 mM Dithiothreitol（DTT）、6 mM MgCl2、および0.01％Triton-X 100を含む緩衝液で実行され、50 µM ATPを添加しました。反応を室温で1時間インキュベートし、2×RNA負荷染料（B0363S;ニューイングランドビオラブ、マサチューセッツ州、米国）を添加して消光しました。反応生成物を8 mの尿素ページを使用して分離し、Davinch Auto Chemi＆Fluoro Imaging（Cas400MF、Davinch K、Seoul、韓国）で視覚化し、ImageJ 1.53V（米国医療研究所、MD、米国医療研究所）で分析しました。
NSP9タンパク質の発現と精製
nmpylationアッセイ
MEPT-SN-PME（20および50 µM）を0.5 µMの組換えSARS-COV-2 RDRP His-TAGタンパク質とともに、NMPylationバッファーで4°Cで1時間インキュベートしました（50 mM HEPES、pH 7.5、2 mM DTT、および1 mM MnCl2）。次に、反応混合物を、5 µMの精製NSP9とウリジン三リン酸（UTP）混合物（1.7 µMのフルオレセイン-12-UTPおよび25 µMのUTP）と室温で30分間インキュベートしました。反応は、β-メルカプトエタノールを含む5倍のSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、95°Cで5分間沸騰させることにより終了しました。タンパク質を12％SDS-PAGEゲルにロードし、NSP9から放出された蛍光をDavinch Auto Chemi＆Fluoroイメージングを使用して検出しました。次に、ゲルをクーマシーブリリアントブルー溶液（40％メタノール、10％酢酸、0.05％クーマシーブリリアントブルー）で染色し、負荷タンパク質NSP9およびRDRPのサイズを確認しました。
免疫蛍光アッセイを使用したベロ細胞におけるSARS-COV-2複製と細胞生存率の評価
SARS-COV-2（βCOV/KOR/KCDC03/2020、NCCP43326、系統a）は、病原体の国家文化コレクションによって提供されました。このウイルスは、2％FBS（GIBCO、MA、USA）および1×抗生物質 – アンチミコティック（GIBCO、MA、USA）を備えたDMEMのVero細胞（CCL-81; ATCC、VA、USA）で伝播しました。細胞をT-175フラスコで成長させ、SARS-COV-2を接種し、5％CO2環境で37°Cで3日間インキュベートしました。 SARS-COV-2ウイルスを採取し、-80°Cで保存しました。
SARS-COV-2複製に対する阻害効果を評価するために、ベロ細胞を、実験の24時間前に黒い384-Well µClearプレート（Greiner Bio-One）でブラック384-Well µClearプレート（Greiner Bio-One）で1.2×104細胞に播種しました。 MEPT-SN-PMEはDMSOで連続的に希釈され、細胞に適用されました。その後、プレートをウイルス感染のためにバイオセーフティレベル3分離施設に移し、SARS-COV-2を0.025の多重性感染症（MOI）で添加し、さらに24時間インキュベートしました。細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、SARS-COV-2 Nタンパク質に対する抗体で免疫染色し、核をDNAフルオロクロムHoechst 33342で視覚化しました。細胞数と感染比を定量化します。ウェルあたりの細胞の総数は、Hoechstで染色された核をカウントすることによって決定されましたが、感染した細胞の数はウイルスNタンパク質の発現に基づいて定量化されました。細胞生存率（％）は、各ウェルの細胞数を模擬グループの平均細胞数に正規化することにより計算されました。抗ウイルス活性は、模擬感染ウェルの平均感染比を100％に設定し、ウイルスに感染した井戸を0.5％DMSOで処理したウイルスに感染した井戸を同じプレート内で0％に設定することにより正規化されました。細胞生存率とウイルス複製の阻害のグラフは、次の方程式を使用してS字の用量反応モデルによって適合しました。[1 + (IC50/X)Hillslope]、PRISM7（GraphPad Software、CA、USA）を使用しています。正規化されたアクティビティデータセットに適合した曲線から、最大阻害濃度（IC50）値の半分が計算されました。すべてのIC50および50％の細胞毒性濃度（CC50）値は重複して測定され、各アッセイの品質はZ’ファクターとパーセンテージの変動係数によって制御されました。
A549-HACE2-TMPRSS2細胞におけるSARS-COV-2-NLUC抗ウイルスアッセイと細胞生存率
A549-HACE2-TMPRSS2細胞は、国立生物基準および制御のための国立研究所から購入し、37°Cで成長し、HAMのF-12 K（Kaighn’s Medium（Gibco、MA、USA）で5％CO2で成長し、10％FBSおよび2 mg/ml Geneticin（Gibco、MA、Gib/ML B（Gib/ML）を補充しました。 1×抗生物質 – アンチミコティック。
A549-HACE2-TMPRSS2細胞（1.0×104細胞/ウェル）を白い384ウェルµクリアープレートに播種しました。翌日、DMSOで調製された2倍の連続希釈シリーズのMEPT-SN-PMEを各ウェルに加え、細胞にSARS-COV-2-NLUC（0.01のMOI）69に感染しました。このアッセイで使用されるウイルスは、祖先の株であり、ベロセルで使用されているものと一致していました。 37°Cで24時間インキュベートした後、Nano-Glo®ルシフェラーゼアッセイシステム（米国ウィスコンシン州プロメガ）を使用して、ルシフェラーゼ基質を各ウェルに添加し、ルシフェラーゼシグナルをVictor Nivo™マルチラベルプレートリーダー（Revvity、MA、USA）を使用して測定しました。製造業者の指示に従って、細胞生存率は、Celltiter-Glo発光細胞生存率アッセイ（米国WI、WI、Wi）を使用して測定されました。 MEPT-SN-PME処理基の相対ルシフェラーゼシグナルは、非感染制御（0％として設定）およびDMSO処理グループ（100％として設定）の相対的なルシフェラーゼシグナルを正規化しました。プロットは、Prism6ソフトウェア（GraphPad、San Diego、CA）を使用して生成され、IC50およびCC50値は非線形回帰モデルを使用して計算されました。
統計分析
すべての実験は、独立して3回行われました。データは、3つの異なる実験の平均±SDとして提示されます。統計分析は、一元配置分散分析（ANOVA）を使用して実行され、その後、GraphPad Prism 3.0（GraphPad Software、MA、USA）を使用したDunnettの多重比較テストが行われました。統計的に有意な値は、として定義されていました ap bp cp *p **p ***p ap ＃pグラフ上のns」。
#SARSコロナウイルス2 #RNA依存RNAポリメラーゼ活性の阻害剤を識別するための細胞ベースのレポーターアッセイの構築と検証