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2025-12-31 16:25:00
このセクションでは、ゲノムを各種クラスターに割り当てるために使用した方法の概要を説明します。また、3 つの異なる方法を使用して種の割り当ての堅牢性を検証し、それらの方法が同一の結果をもたらすことを示します。
細菌集団のゲノムを比較すると、さまざまな長さと発散スケールのクラスターが明らかになります (ジェインほか、2018）。しかし、そのようなクラスターの解釈には議論の余地があります (コーハン、2002; フレイザーら、2009）。このようなパターンについては、主に 3 つの解釈が考えられます。 1 つの解釈は、クラスターは真核生物種の細菌類似体を表しており、性的および生態学的に互いに隔離されているというものです。実際には、細菌種を定義するために、全ゲノム相違カットオフ 5% がよく使用されます (ジェインほか、2018）。別の解釈としては、クラスターは、はるかに多様で、おそらくより遺伝的に均一な集団からの特定の株のクローン拡大の結果であるというものです。 3 番目の解釈は、クラスターはより大規模でより多様な母集団からの不均一なサンプリングの結果であるというものです。地理的に隔離された集団から、組成の偏りが最小限に抑えられたゲノムの大規模なコレクションを取得するというユニークな組み合わせにより、これらの代替案をテストすることが可能になります。私たちは主に、サンプル中に強力なゲノムクラスターがあるかどうかをチェックすることによって、最初の 2 つの解釈と 3 番目の解釈を区別することを目的としています。最初の 2 つの仮説に関する証拠の詳細については、付録 3 および 5 を参照してください。
ゲノムが堅牢なクラスターを形成しているかどうかを確認するために、3 つの異なる方法を使用しました。16S rRNA 配列の系統樹、2 つの参照ゲノム OS-A および OS-B’ からのゲノム全体の平均分岐、および異なる遺伝子座にある SAG と 2 つの参照配列によって形成されたトリプレット間の分岐パターンです。 16S の系統樹は、自然の微生物群集の多様性を特徴付けるために最も単純であり、現在でも最も一般的に使用されている方法です (ヤルザほか、2014）。実用上重要であるため、他の 2 つの方法との比較のためにこれを含めました。しかし、イエローストーンのような高度に再結合する集団では、 シネココッカス16S の多様性が全ゲノムの多様性をどの程度正確に反映しているかは不明です。この疑問に答えるために、ゲノム全体にわたる相違を比較として使用しました。ゲノム全体にわたる平均発散などの要約統計量を使用することの主な制限は、生態学的および進化的に重要な影響を及ぼし得るゲノムに沿った異質性が曖昧になってしまうことです。この懸念に対処するにはさまざまな方法があります。ここでは、最初に使用されたメソッドの拡張を使用しました。 ローゼンら、2018、これは、さまざまな遺伝子座にわたる多様性パターンの変動の大まかな説明を提供します。次に、これらの各分析の結果を示します。
我々はまず 16S 配列の系統樹を構築しました。予測された 16S rRNA 配列 (フィルター処理された 331 個の SAG から 117 個) が抽出され、MAFFT (v7.453) を使用して整列されました (加藤とスタンドリー、2013）。 2 つの配列 (SAG MA02M11_3 および MuA02C9) は不完全であったため、分析から除外されました。残りの (115) シーケンスは、Scipy に実装された平均リンケージ (UPGMA) メソッドを使用して階層的にクラスター化されました。結果は次のとおりです。 付録 2—図 3、色付きの背景は、比較のために全ゲノムの多様性 (以下を参照) を使用した種の割り当てを示しています。我々は、全ゲノムの割り当てと 16S 系統樹の最大の 3 つのクラスターとの間に完全な一致を発見しました。
内の平均発散 ある クラスターは約半分 b (1⋅10−3 対 2⋅10−3)。ただし、平均乖離のかなりの部分は、 b これは 2 つの外れ値 (MuA1L16 および MusA1J8) によるものでした。外れ値を除去した後、範囲内での平均発散は b 1.7⋅10−3まで減少しました。アライメントを詳しく調査すると、両方とも異常値であることが明らかになりました。 b 配列には、すべて同一の 3 つの SNP の短いセグメントが含まれていました。 ある シーケンスがあり、他のものとは異なります b 位置 1067 ～ 1072 の配列。さらに、MuA1L16 には、10 個の SNP と他のすべてとは異なる挿入を含む、ほぼ 200 bp (位置 390 ～ 570) のより大きなセグメントが含まれていました。 b そしてコンセンサスαと同一であった。これらのセグメントとは別に、外れ値シーケンスは典型的なものでした。 b 種。このパターンは、本文および付録 6 で説明されている SNP ブロックに似ているため、SNP ブロック間のハイブリダイゼーションの結果である可能性があります。 ある そして b。
我々は、16S rRNA クラスターを 2 つの参照ゲノム、OS-A および OS-B’ からの全ゲノムの相違と比較しました。 BLAST (v2.13.0+) を使用して、各 SAG からのすべての予測遺伝子を、各参照ゲノムからのすべてのコーディング DNA 配列 (CDS) とアライメントしました (アルトシュルら、1990）。各 SAG について、各参照ゲノムとの相違 (d=1-pident/100) を計算し、すべての遺伝子にわたるベストヒットの平均を計算しました。両方の参照に 100 件を超えるヒットがあるすべての SAG の結果を以下に示します。 図1A。 3 つの明確なクラスターが観察され、次のようにラベル付けされました。 ある、 b、 そして c。各 SAG の種は、それが属するクラスターに対応するラベルとして割り当てられました。 図5A。
各 SAG について、OS-A および OS-B’ とオルソロガスであるすべての遺伝子を、上記の 5 つのパターンのいずれかに割り当てました。の 3 行は、 付録 2—図 1 の典型的な例を示します ある (付録 2—図 1A)、 b (付録 2—図 1B)、そして c (付録 2—図 1C) サグ。の各行にわたる遺伝子の大部分 付録 2—図 1 は、それぞれ XA-B、XB-A、X-A-B パターンで見つかります。これは、以前にゲノム全体の平均乖離で見られた種クラスターと一致しています。しかし、他のパターンを形成するかなり少数の遺伝子も見つかりました。最も顕著なのは、3 つの配列すべてがメイン クラウド (ddM) 内にある遺伝子を表す XAB です。これらの遺伝子の一部は、本文で説明した分岐谷に含まれていました。の場合、 c SAG、X-A-B が支配的なパターンであるという事実は、次の可能性を排除します。 c αとαの混合から生じるハイブリッドです。 b。このような雑種は、酸性鉱山の排水微生物群集における最近のクローン増殖後に観察されています（タイソンら、2004; ロー他、2007）、しかし、イエローストーンコミュニティにはそれほど頻繁には存在していないようです。その代わりに、どうやら c 同時期に他の2種から分岐した別個の種である ある そして b 互いに乖離した。
上で説明したパターンを使用すると、異なる SAG を相互に比較でき、ゲノム全体の平均的な相違に基づいて種の割り当ての堅牢性をテストできます。具体的には、各パターンを持つ遺伝子の割合を表す遺伝子トリプル フィンガープリント f=(fXA−B,fXAB,fX−A−B,fX−AB,fXB−A) を各 SAG に割り当てました (∑ifi=1 であることに注意してください)。次に、各 SAG のフィンガープリントを、OS-A および OS-B’ からの平均乖離に基づいた種の割り当てと比較しました。 図1A。フィンガープリントは、平均発散に基づく割り当てと正確に一致する 3 つの明確なパターンを形成していることがわかりました (付録 2—図 2）。この割り当てを 1% から 20% の範囲のさまざまな dM 値に対してテストしたところ、指紋パターンが全範囲にわたって堅牢であることがわかりました (データは示されていません)。これらの結果は、個別の種への分類が、記載されている 3 つの方法にわたって堅牢で一貫していることを示しています。
遺伝子レベルの種クラスターは、ゲノムレベルのものとほぼ一致します。
図は、OS-A および OS-B’ 参照ゲノムに対する 3 つの細胞の遺伝子ごとの比較を示しています。示されているセルは代表的なものです。 ある (あ; OctA1J9) と b (B; MA02H14_2) クラスターと 1 つの γ セル (C; ocA3L13)。 OS-A と OS-B’ の両方にホモログを持つ各コア遺伝子を参照と比較し、各辺の長さが所定のペア間の相違に等しい三角形として相違をプロットしました。セル配列は黒い点で表され、OS-A 配列と OS-B’ 配列はそれぞれオレンジ色の上向き三角形と青色の下向き三角形で表されます。黒丸は、各遺伝子を分類するためのカットオフとして選択された半径 10% です。さまざまな列には、次のようにラベル付けされた 5 つの可能なパターンのいずれかの遺伝子が表示されます: XA–B (細胞配列は OS-A から 10% 未満、OS-B’ からは 10% を超えて分岐)、XAB (3 つの配列すべてが相互に 10% 以内にある)、X-A-B (3 つの配列すべてが互いに 10% を超えて相違している)、X-AB (細胞が両方から 10% を超えて分岐している) OS-A と OS-B’、ただし両方の参照の相違は相互に 10% 未満です）、および XB-A（セルは OS-B’ からの相違は 10% 未満、OS-A からの相違は 10% を超えています）。
遺伝子トリプレット パターンの割合は、3 つの異なるクラスターを示します。
5 つのパターンのそれぞれに含まれる遺伝子の割合を図に示します。 付録 2—図 1 当社の品質管理基準に合格した各セルについて表示されます (付録 A を参照)。線はさまざまな細胞を表し、全ゲノムの多様性に基づいた種の分類に従って色付けされています。
16S rRNA から推定された系統樹は、全ゲノムの種分類と一致します。
品質管理に合格したすべての 16S 配列間のペアごとの相違は、MAFFT を使用して実行された複数の配列アラインメントから計算されました (加藤とスタンドリー、2013）。このツリーは、SciPy (ヴィルタネンほか、2020）。
#ハイブリダイゼーションはシアノバクテリア集団の長期共進化における種の壁を打ち破る