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2025-10-17 13:11:00
実験場所
この実験は、2023年10月から2024年5月まで、ブラジルのゴイアス州リオベルデ市にある商業牛農場で実施されました。ここは熱帯地域で、1 年に 2 つの明確な季節があります。雨の多い夏 (10 月から 4 月) の年間平均降水量は 1541 mm、乾燥した冬 (5 月から 9 月) の平均降水量は 150 ～ 200 mm です。
この農場には約4500頭の牛がいます。牛はアンガス 1/2 × ネロア 1/2 で、子牛はアンガス 1/2 × ネロア 1/2 とネロレ 3/4 と人工授精で得られます。牛の生殖状態にもよりますが、牛は平均して 5 回目の妊娠まで農場に留まります。すべての雄子牛と一部の雌子牛は、離乳後に閉じ込められ、生後約 14 か月で屠殺されます。 1/2 アンガス × 1/2 ネロールの雌子牛の一部は、離乳後、平均して妊娠 5 回目まで農場に残ります。この農場の牛には寄生虫が寄生している R.マイクロプラス TF病原体との接触を維持します。散発的な発生 A. 限界 生後17日から25日の子牛に発生します。 [6]。生後 4 か月を過ぎると、放牧で飼育された動物は TF 病原体による臨床的問題を示さなくなり、この月齢以降の動物における TF 病原体に対する環境安定性が示唆されます。
過去 12 年間、この農場での牛のダニ駆除は、ダニの存在を視覚的に評価するための動物の検査に基づいた治療と、農場スタッフによって確立された経験的基準に基づいて行われてきました。使用されるダニ治療剤は、フィプロニル 1.25 mg/kg + フルアズロン 2.5 mg/kg のポアオン製剤 (TickGard®、MSD Animal Health) です。 2.5 mg/kg のポアオン フルララナー (Exzolt® 5%、MSD Animal Health) は、この研究が開始されるまでこの農場で使用されたことはありませんでした。
動物、群、治療法、実験期間
この研究では、出生時から内部寄生虫や外部寄生虫の治療を受けておらず、自然に感染している3/4ヨーロピアン×1/4ネロールの雄雌子牛100頭を使用しました。 R.マイクロプラス 勉強の初めに。これらの動物が平均生後 25 日になったときに、それぞれ 50 匹ずつの 2 つのグループ、FIFLUA と FLU に分けました。 FIFLUA 群はフィプロニル 1.25 mg/kg + フルアズロン 2.5 mg/kg (TickGard®、MSD Animal Health) の市販のポアオン製剤で治療し、FLU グループはフルララナー 2.5 mg/kg (Exzolt® 5%、MSD Animal Health) のポアオン製剤で治療しました。実験期間は子牛の年齢に基づいた。生後25日から平均241日で離乳するまで観察した。動物をグループに割り当てる基準は、ダニの数/負担、動物の年齢、性別に基づいていました。無作為化後、各グループは平均ダニ数（FLU = 1.9 ± 2.5; FIFLUA = 1.8 ± 2.4）、日数（FLU = 25.3 ± 4.14; FIFLUA = 25.6 ± 5.24）、性別（FLU および FIFLUA = それぞれ女性 23 名、男性 27 名）において均一でした。
実験期間（生後 25 日から 241 日）を通して、各グループは異なる牧場に留まり、それぞれの母親はサイズも草の有無も実質的に同じであり、各グループは実験期間を通して他のグループから隔離された状態に保たれました。子牛には全期間を通じて母牛の全乳を与えました。 ブラキアリア・ブリザンタ そして水は自由に与えます。
に対する戦略的治療法 R.マイクロプラス ふくらはぎに
FIFLUA グループは対照として機能しました。このグループの動物の治療に使用された市販製品は、すでに農場で使用されていました。さらに、農場で採用された治療を受けた動物は、生後約 2 ～ 4 か月後には TF 病原体の臨床症状を示さなくなり、TF 病原体が動物間で安定していることが示唆されました。最初の治療は、このグループのすべての動物に対して生後 25 日目に行われました。したがって、FIFLUA グループの治療基準は農場スタッフの実践に一致しました。これが起こったとき、グループ内の 50 匹の動物すべてが治療を受けました。
FLU グループの最初の治療は研究の開始時に行われました (生後 25 日の動物)。 FLU グループの子牛は、バッチの 30% (15/50) 以上が感染した場合にフルララナーで再治療されました。 R.マイクロプラス 寄生数 13]、動物あたりのマダニの数とは無関係。いずれの場合も、50 匹すべての動物が治療されました。 FLU グループの動物の視覚検査は、実験中ずっと牧草地で毎週の間隔で実施されました。
各グループの牛には子牛と同じ殺ダニ剤が投与されましたが、研究の開始時に1回だけ投与されました。さらに、以下に説明する他の活動は牛には適用されませんでした。
ダニ数とTFの環境安定性の評価
女性 R.マイクロプラス 各動物の左側に存在するダニ（長さ 4.5 ～ 8 mm）を（2 倍せずに）すべての子牛で数えました。 [14] 研究の開始時（生後 25 日）に動物をグループに分けます。次に、両グループ (FIFLUA および FLU) の平均年齢 60、135、188、および 241 日 (離乳) でダニの数を数えました。
群れの環境安定性は、動物の生後 25、60、135、188、および 241 日のダニ数と同じ日に、間接酵素免疫吸着法 (iELISA) によって評価されました。この目的のために、グループあたり 15 匹の動物の血清または血液がランダムに選択され、実験期間全体を通じて評価されました。に対する免疫グロブリン G (IgG) 抗体 A. 限界、 B.ウシ科、 そして B.ビゲミナ に記載されたプロトコルに従って iELISA によって検出されました。 [15, 16]。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を使用して、各グループの動物が TF 病原体に曝露される頻度を決定しました。 3 つの薬剤の DNA を検出するために、メーカーの指示に従って、DNAeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen、Valencia、CA、USA) を使用して、血液サンプル (300 μl) から DNA 抽出を行いました。抽出された DNA は、2 つの異なる qPCR アプローチを使用してテストされました: モノプレックス qPCR アッセイ A. 限界 および二重 qPCR アッセイのターゲティング B.ウシ科 そして B.ビゲミナ。モノプレックス qPCR アッセイは、主要表面タンパク質 1b (msp1b) 遺伝子のフラグメントを標的としました。 A. 限界 [17]。二重 qPCR アッセイは、ミトコンドリアのシトクロム B (cytB) 遺伝子を標的としました。 B.ウシ科 そして B.ビゲミナで説明されているように、 [18]、クエンチャーに修飾を加えたもの（表 1）。各 qPCR 実行には、ネガティブ コントロール (PCR グレードの水、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) と適切なポジティブ コントロール サンプル (DNA A. 限界、 B.ウシ科、 または B.ビゲミナ）。
表 1 本研究で使用したオリゴヌクレオチド（プライマーおよびプローブ）
すべての qPCR アッセイは、メーカーの推奨に従って TaqMan® Environmental Master Mix 2.0 (Applied Biosystems®、米国カリフォルニア州フォスターシティ) を使用し、StepOnePlus™ Real-Time PCR System サーマルサイクラー (Applied Biosystems®、米国カリフォルニア州フォスターシティ) で実行されました。熱サイクル条件は、95℃で10分間の最初のDNAポリメラーゼ活性化、その後の95℃で15秒間の変性および60℃で1分間のアニーリング伸長の40サイクルから構成されていました。すべてのアッセイにおいて、CT 値が低いほど開始テンプレートの量が多いことに対応し、陰性結果は CT 値が 35 サイクルを超えるものとして定義されました。陰性サンプルは、哺乳動物のミトコンドリアのシトクロム B (cytB) タンパク質遺伝子の 359 bp フラグメントをターゲットとする従来の PCR プロトコールを使用してさらにテストされました。 [19] DNA抽出手順を検証します。この PCR アッセイでサンプルが生成物を生成しなかった場合、そのサンプルはさらなる分析から除外されました。メーカーの推奨に従って、SYBR Safe (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で PCR 産物を染色し、紫外線トランスイルミネーター下で 1.5% アガロースゲル電気泳動によって視覚化しました。
によると [8] そして [9]、群れは動物飼育上安定していると考えられています。 バベシア 種そして A. 限界 動物の 75% 以上が血清学的にこれらの病原体に対して陽性である場合。したがって、この研究では、グループ内の動物の 75% 以上が血清学的検査で陽性であった場合に、3 つの TF 病原体それぞれについて環境安定性を考慮し、qPCR を使用して各グループの動物が TF 病原体に曝露される頻度を確認しました。
血液塗抹標本: バベシア 種寄生虫症と A. 限界 菌血症
血液塗抹標本は実験全体を通して行われ、計算が行われました。 バベシア 種寄生虫症と A. 限界 子牛の菌血症。しかし、この技術は感度が低いため、環境安定性の評価には考慮されていませんでした。寄生虫学的診断は、生後 25、60、135、188、および 241 日の両群のすべての動物から得られた TF 病原体の血液塗抹標本によって決定されました。子牛の尾の先端から血液を採取し、ギムザ染色し、倍率1000倍の顕微鏡で検査した。 TF 病原体に対する寄生虫血症または菌血症の割合は、以下に記載されている方法を使用して決定されました。 [20, 21]。
TF病原体に対する研究中の動物の救済処置
実験期間全体を通じて動物福祉を確保するため、子牛が TF 病原体の臨床症状を示した場合、この動物はジミナゼン 3.5 mg/kg (Ganazeg®、Elanco Animal Health) による救済処置を受けました。 [22]) プラス 7.5 mg/kg エンロフロキサシン筋肉内投与 (Knetomax®、Elanco Animal Health) [23]）。これらの兆候には、頭、耳、まぶたが垂れ下がっていることが含まれており、これに、問題の動物が群れからより孤立していること、または群れが移動している間にその動物が群れの残りの部分についていくことができないという事実が組み合わされていました。これが起こるたびに、動物の識別名と日付が記録され、どの TF 因子が関与しているかの診断を確認するために血液塗抹標本が実行されました。
統計分析
ダニ数と血清学的検査のデータは、データを log(count + 1) に変換した後でも、正規性、分散の均一性、残差、ランダム性の仮定を満たしていませんでした。したがって、クラスカル-ウォリス検定を使用して実験グループを比較しました。
すべての統計手順は統計分析システムを使用して実行されました。 [24]、バージョン 9.4 (2016)。差異が統計的に有意であるとみなされたのは、次の場合です。 P
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