図1：GREK1は、複数のMERSR-COVの感染を強力に阻害しました。
a αおよびβコロナウイルスからの代表的なCOVのSシーケンスで作成された隣接結合（NJ）ツリー。 b MERS-COVと比較したMERSR-COVのSタンパク質の関数ドメインの同一性。 c MJHKU4R-HR1P/EK1相互作用のネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（N-PAGE）分析。新しい6-HBバンドには紫色の矢印が付いていますが、赤い矢印はEK1バンドを示します。 d MJHKU4R-HR1P、EK1およびMJHKU4R-HR1P/EK1複合体の循環二色性（CD）スペクトル。 e MJHKU4R-HR1PおよびEK1によって形成された複合体の融解曲線。 f EK1またはEK1スクランブル（EK1-SCR）の存在下で2時間共培養後にMJHKU4R-Sと標的細胞（CACO-2）を発現するエフェクター細胞間の細胞細胞融合の代表的な画像。スケールバー、150μm。 g MJHKU4R-Sによって媒介される細胞と細胞融合に対するEK1の広範なスペクトルと効力。 h MJHKU4R-COV-1 HR1/EK1複合体（左、PDB：8x5p）およびSARS-COV-2-HR1/EK1複合体（右、PDB：7C53）の結晶構造の漫画表現。 HR1とEK1は、それぞれ緑とホットピンクの色です。 私 MJHKU4R-COV-1 HR1/HR2（PDB：8x5O）とHR1/EK1の構造比較。重要な残基は、ズームインビューのスティックとして強調表示されます。 j MERSR-COVSのSタンパク質のS2サブユニットのS1サブユニットまたはHR1のいずれかを標的とするGRFT、EK1および介在（G4S）5リンカーを含む、GRFT、EK1および介在（G4S）5リンカーを含む二価融合阻害剤GREK1の概略図。 k–n 偽型MjHKU4R-COV-1に対するGREK1の有効性（k）、neocov（l）、PDF-2180（m）およびhku5- neil-2（n） 感染。 o–Q grftおよびgrek1の代表的な画像は、伝播に適したPCVSV-PNNL2180B感染を阻害します（o）。 PCVSV-PNNL2180Bに対するGRFTおよびGREK1の抗ウイルス効力の定量化（p）またはPCVSV-MOW15-22（Q） 感染。
ここでは、これらのMERSR-COVのS2サブユニットが、特にHR1領域で高い保護を示し、ウイルス6 HB融合コア形成に関与する重要な機能的ドメインであることがわかりました。これらはすべて、MERS-COV-HR1と80％以上の配列同一性を示しました（図1B;補足図S1B、C）。一貫して、これらのMERSR-COVのすべてのHR1由来ペプチド（HR1PS）は、PAN-COV融合阻害剤EK17と相互作用することができ、したがって、天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動（N-PAGE）に新しいバンドを形成します（図1C;補足図S2）。
一方、MJHKU4R-COV-1 HR1Pは、MERSR-COV HR1由来の代表的なペプチドとして使用されました。これは、円形二色（CD）スペクトルにαヘリシティが低い主にランダムコイル構造を示しました（図1D）。特に、HR1PとEK1の混合物は、αヘリシティが大幅に増加した複合体を形成しました。熱変性分析により、HR1P/EK1複合体の熱安定性が高く、融解温度（TM）が88.9°Cであることがさらに実証されました（図1E）。これらの発見は、EK1がMERSR-COVのHR1領域に効果的かつ競合的に結合することができることを確認し、安定した異種6馬力の形成をもたらすことがわかります。
重要なことに、EK1は、MJHKU4R-COV-1 Sを介した膜融合を用量依存的に有意に阻害し、18.03 nmのIC50（図1F、G）を備えており、プロトタイプMERS-COV媒介Fusion7の阻害よりも約10倍強力です。さらに、EK1は、51.98 nmから86.39 nmの範囲のIC50値を持つNeoCov、PDF-2180、MOW15-22、PNNL2018B Sを介した細胞融合を強力にブロックしました（補足図S3）。これらの結果は、EK1がこれらのMERSR-COVに対して広範かつ強力な融合阻害活性を発揮することを集合的に示しています。
一方、MJHKU4R-HR1/EK1複合体（PDB：8x5p）の結晶構造を成功裏に解決しました。その全体的なアーキテクチャは、SARS-COV-2-HR1/EK1複合体（PDB：7C53）8（図1H;補足図S4A、B）の構造によく似ています。この構造により、EK1はMJHKU4R-HR1ドメインを特異的に標的としており（図1H、I;補足表S1）、ウイルスHR2領域を競争的に置き換えて安定した擬似6-HBを形成し、それにより、膜融合とウイルスの侵入に不可欠なネイティブの6-HB形成を効果的にブロックします。シーケンスアライメントは、EK1がHR1領域に対する強力な結合親和性に寄与するMJHKU4R-COV-1のHR2ドメインと高い相同性を共有することを示しました（図1I;補足図S4A）。特に、EK1は、天然のウイルスHR2ペプチドと比較して、構造の安定性の向上を実証しました。構造分析により、EK1では、残基Lys18がGlu21とTyr14を備えた塩橋を形成し、そのらせん構造の溶解度と完全性に寄与することが示されました（図1I）。対照的に、MJHKU4R-COV-1 HR2ドメインでは、ILE1275はASP1271とGLU1278の間の同等の位置を占め、潜在的な相互作用を破壊し、構造の安定性を低下させます（図1I）。
さらに、Alphaold39を使用して、これらのウイルスのHR1領域に結合したEK1の構造を予測しました。これらの予測された構造と分解された結晶構造（補足図S4C）との比較により、EK1はこれらすべてのMERSR-COVのHR1トリマーに高度に保存された立体構造で結合し、これらのウイルスHR1領域の高度な配列保存と整合できることが示されました。シーケンスアライメントによれば、これらのMERSR-COVはHR1に限定的な点変異を示します。これらの突然変異部位の詳細な分析により、それらのどれがHR1に結合するEK1の能力を妨害または弱めることはないことが明らかになりました。たとえば、MJHKU4R-COV-1のL1001がネオコフのIに変異している場合、EK1のI31との疎水性相互作用を維持します。ただし、PNNL2018BでQに変異すると、EK1のE35と相互作用する傾向があります。これは、EK1がそれ自体の残基の側鎖の立体構造を変更し、それによって広範囲の抗ウイルス活性を示すことにより、HR1に合う柔軟性を持っていることを示しています（補足図S4）。
コロナウイルスの表面での高度なグリコシル化を考えると、ウイルスグリカンは抗ウイルス介入の2番目の保存された標的を表しています。よく特徴付けられた抗ウイルスレクチンであるグリフィスシン（GRFT）は、S Protein10でこれらのグリカンに特異的に結合することができ、それによりウイルス侵入を阻害します。この原則に基づいて、さらに、GRFTのグリカンターゲティング能力をEK1のHR1結合ドメインと組み合わせた二価融合阻害剤GREK1の融合阻害活性をさらに評価しました（図1J）。
予想どおり、GREK1はMJHKU4R-COV-1、NEOCOV、PDF-2180、MOW15-22、およびPNNL2018B Sを介した細胞細胞融合を用量依存的に強く阻害しました。これらのIC50値は、GRFT単独（IC50：0.79–4.29 nm）よりも12〜24倍大きな効力を表し、EK1単独（IC50：22.53–83.29 nm）よりも1415〜1415倍の効力を表します（補足図S5）。さらに、HKU5-COV-2のSタンパク質は、CACO-2-で有意な膜融合を促進しました。Pipistrellus nathusii （p.nat）-ACE2細胞（補足図S6A）は、EK1（5 µM）によって完全に阻害される可能性があります。さらに、GREK1は、0.19 nmのIC50を持つHKU5-COV-2に対して強力な融合阻害活性を示し、GRFTのみ（IC50：3.90 nm）またはEK1単独（IC50：223.00 nm）を大幅に超えました（補足図S6B）。
GREK1の特定の抗ウイルス活性をさらに評価するために、HIVベースの偽ウイルス（PSV）System12を使用して感染をブロックする際の有効性をテストしました。驚くべきことに、GREK1は、IC50値が0.02–0.35 nmのすべてのテストされた偽型MJHKU4R-COV-1、NEOCOV、PDF-2180、およびHKU5-COV-2に対して有意に強化された効力を実証しました（図1K – N）。これらの値は、GRFT（IC50：0.43–6.67 nm）およびEK1（IC50：43.17–248.90 nm）の値よりも著しく低く、二価GREK1分子の優れた抗ウイルス効果をさらにサポートしています。さらに、PNNL2180B-Sタンパク質（PCVSV-PNNL2180B）またはMOW15-22-Sタンパク質（PCVSV-MOW15-22）を持つ伝播能力のある組換え口炎ウイルスウイルス（PCVSV-MOW15-22）、GREK1は低濃度でウイルス複製を完全に抑制しました（図1O – Q;補足図S7）。定量分析により、GREK1は例外的な抗ウイルス効力を示し、PCVSV-PNNL2180B（図1O、P）とPCVSV-MOW15-22（図1Q;補足図S7）感染3に対して0.01 nmのIC50値を示したことが明らかになりました。これらの値は、同じモデルでEK1よりもGRFTよりも約118〜128倍の有効性と5580〜45,100倍大きいことを表しています（図1O – Q;補足図S7）。一緒に、これらの発見は、GREK1が、親コンポーネントの有効性を大きく上回る、多様なMERSR-COVに対して広範囲にわたる活性を持つ非常に効果的な抗ウイルス剤であることを示しています。
#デュアルターゲティング戦略により新たなMERS関連のコロナウイルスの非常に強力で幅広い阻害が可能になります