倫理声明
この研究のプロトコルは、ポーランドのオルシティンにあるウォーミア大学とマズリー大学（UWM）の動物実験に関する地元の倫理委員会によってレビューおよび承認されました（決議番号41/2019）。すべてのサンプリングは、ポーランドのオルシティンの獣医学部、獣医学部、獣医学部の患者である鳥の標準的な臨床検査中に行われました。所有者から、ハトから房孔サンプルを収集し、研究でそれらを使用する許可が得られました。研究のために鳥の資格に使用される糞便サンプルは、所有者によって提供されました。サンプリングは非侵襲的であり、すべてのハトはサンプル収集後に生きて無傷でした。すべての方法は、関連するガイドラインと規制に従って実行され、到着ガイドラインに従って報告されています。
サンプル収集
サンプリングのためのハトの資格については、ukaszuk et al.16,17によって詳細に説明されています。クロアカルスワブサンプルは、腸疾患の兆候が最近観察された24の群れ（研究群）と最近の疾患の発生のない13の群れに由来する63の健康な鳩（対照群）に由来する90の鳩から収集されました。テストされたすべてのハトは1歳未満で、糞便検査に基づいて病原性細菌、真菌、および/または寄生虫が含まれていませんでした。サンプリング後、個々のスワブは、ウイルス、マイコプラズマ、尿素プラズマだけでなく、ウイルスの普遍的な液体輸送培地に浸されました（Copan Diagnostics、Murrieta、California、USA）、さらに2つの部分に分割され、分析まで-80°C -80°Cで保存されました。
シーケンスとバイオインフォマティック分析
オックスフォードナノポアシーケンス
ゲノム注釈と系統解析
Open Readingフレーム（ORF）は、Find ORFSツールを使用してコロナウイルスシーケンスで決定され、どちらもGeneious Prime Softwarev。2025.0.3（Dotmatics、ボストン、マサチューセッツ州、米国）で利用可能なBlastツールで注釈を付けました。レプリカーゼポリタンパク質の保存されたドメインの推定位置は、他の鳥コロナウイルス配列（M95169、EU095850、MK359255およびKM454473）とのアラインメントに基づいて特定されました。 BLAST Search22を使用して、GenBankデータベース（NCBI）で同様のシーケンスを識別しました。このように、2つのガンマコロナウイルス配列データセットが作成されました。1つは完全なゲノム配列と、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RDRP）フラグメントを含むさまざまな長さの完全かつ部分的な配列の2番目と部分的な配列で構成されました。両方のセットのシーケンスはMAFFT Method24と整列し、2番目のセットのシーケンスは最短シーケンスの長さにトリミングされ、すべてGeneious Primeソフトウェアのアミノ酸に翻訳されました。次に、セットを使用して、SDT v1.3ソフトウェア25でペアワイズアイデンティティマトリックスを生成しました。次に、MEGA 11ソフトウェア26の発見DNA/タンパク質モデルツールで最も適切とみなされる置換モデルを使用した最尤系系統樹は、IQ-Tree 1.6.12 Software27,28を使用して1000のブートストラップ複製で推測されました。系統樹をITOL V6ソフトウェア29で視覚化しました。最後に、鳩のガンマコロナウイルスの新たに入手され注釈された完全なシーケンスは、アクセッション番号PQ679936の下でGenbank（NCBI）に堆積しました。
再結合分析
RDP5ソフトウェアを使用して、デフォルトパラメーターと次の方法で組換えの証拠を特定しました：RDP、Geneconv、Bootscan、Maxchi、Chimaera、Siscan、および3seq30、31、32、33、34、35、36、37。最低3つの方法で検出された組換えイベントのみ p
定量分析
RNA抽出と逆転写
RNAは、メーカーの指示に従って、Total RNA Mini Plus Kit（A＆A Biotechnology、GDABINK、POLAND）を使用して、輸送媒体の第2部から抽出されました。抽出されたRNAは、ナノドロップ2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts、USA）を使用して純度と濃度を決定する前に、50μLのヌクレアーゼを含まない水で溶出しました。次に、cDNAを8 µLのRNAと5x Primescript RT Master Mix（Takara Bio、Kusatsu、日本）で2 µLの逆転写を実行することにより合成されました。最後に、サンプルをさらに分析するまで-80°Cで凍結しました。
Taqmanの定量的PCR
Taqman QPCRアッセイは、サンプルをテストして、鳩のガンマコロナウイルスの存在をテストしました。プライマー（フォワード：5′-ATGTAAAGCCTGGTGGGACT-3 ‘およびリバース：5′-Agacgcgcaacattagctga-3’）およびプローブ（5’-[HEX]tggtgatgccacaactgctt [BHQ-1]-3 ‘）は、この研究で決定されたシーケンスを使用して、GenBank：OM366013、OM366013、MK617492、KP033084、KT222633から取得したシーケンスを使用して、Genious Primeソフトウェアで利用可能なデザインの新しいプライマーツールを使用して設計されました。アッセイは、RDRP遺伝子の100 bpフラグメントを標的とします。反応混合物は、10 µLのTaqman™ファストユニバーサルPCRマスターミックス（Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts）、両方の10 µMプライマー1.8 µl、2.5 µMプローブ2 µl、ヌクレアーゼを含まない水1.4 µl、CDNA 3 µLを混合することにより、調製しました。 Lightcycler®96システムサーモサイクラー（ロシュ、バーゼル、スイス）で実行される反応の条件は、次のとおりでした：95°Cで30秒間、95°Cの40サイクル、15秒間、59°Cで40サイクルでした。
開発されたアッセイの特異性と感度は、サンプルをテストする前に評価されました。特異性を評価するために、反応は、ピガオンロタウイルスA（PP849436）、ピジョンアストロウイルス（PP478075）、ピガオンピコナウイルスB（PP735155）、Megrivirus B（PP735150）などのAvian Corron b（PP735150）などの他の既知の鳩ウイルスの遺伝物質を含むサンプルで実行されました。感染性気管支炎ウイルス（質量様株とバリアント株）およびカモメのデルタコロナウイルス。コロナウイルス株は、カタルジナ・ドメスカ・ブリチャルツ（ポーランド州プウワイ獣医研究所）によって親切に提供され、他の株は、ポーランドのオルシンティンの獣医学部、獣医学部の家禽疾患学部のコレクションに由来しました。
感度は、次のように開発したコントロールの標準曲線に基づいて決定されました。 Geneious Primeソフトウェアを使用して、QPCRアッセイ領域にまたがる802 bpフラグメントを標的とするプライマー（Forward：5′-TGTTGCCCACCACACTAACTCAG-3 ‘およびREVERSE：5’-AACCCAGCACTTGAGTCG-3’）を設計しました。反応混合物は、10μlのHotstar Taqplus DNAポリメラーゼ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）、0.1μlの両方の100μMプライマー、6.8μlのヌクレアーゼを含まない水、および3μlのピガオンコロナウイルスcDNAで構成されていました。 PCR反応は、マスターサイクラーサーマルサイクラー（エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ）で、次のサーマルサイクリング条件で実施しました：95°Cで5分間、94°Cの40サイクル、1分間、56°Cで1分、72°Cで1分、その後72°Cで10分間。得られたアンプリコンは、クリーンアップキット（A＆A Biotechnology、ポーランド）およびNanodrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts、USA）を使用して濃度と純度を決定するために精製しました。遺伝子コピー数は、コピー数計算機（ロードアイランド大学のゲノミクスおよびシーケンシングセンター、ロードアイランド州キングストン）で計算されました。最後に、Taqman QPCRは、テンプレートとして使用されるAmplicon/μLの3.7×107から3.7×103コピーの一連の10進希釈で実行され、すべてのサンプルを3回テストしました。
その後、サンプルの適切な検査を実施し、ポーランドのオルシンティンの獣医学部である家禽疾患学部のサンプルを陽性対照として使用して実施しました（OM366031）。すべてのサンプルは重複してテストされ、CQ 35以下のサンプルは陽性と見なされました。
ドロップレットデジタルPCR
統計分析
期待値に基づいて、V二乗検定（V2）は、ウイルスの検出率とハトの健康状態との相関を評価するのに最も適切であると見なされました。ハトの健康状態と陽性サンプルにおけるウイルス遺伝物質の量の相関については、Mann – Whitney Uノンパラメトリックテストを使用してテストされました。違いは重要であると考えられていました p
#下痢のハトのコロナウイルスと新しいハトガンマコロナウイルスの完全なゲノムの最初の決定