マウス
nod.cb17-prkdcscid/tcu（nod/scid）およびnod/shi-scid il2rgamma（null）（nog）マウスを飼育し、国立健康研究研究所の実験動物センターで維持しました。 4週齢のマウスは、この研究のレシピエントを務めました。マウスは、25°Cの一定温度で制御された条件下で収容され、自由に食料と水にアクセスできました。光サイクルは、12時間の光と12時間の闇に設定されました。すべての動物実験は、国民健康研究機関の施設内動物管理委員会（NHRI-IACUC-100034-A、NHRI-IACUC-100126-A、NHRI-IACUC-102011-A、NHRI-IACUC-008110A、NHRI-IACUC-10039-AAEによって承認されたプロトコルに準拠して実施されました。 NHRI-IACUC-108110M2-AE-S01）。
人間のMSCと人間のHSCの文化
Human Bone Marrow由来のMSC（＃PT-2501）は、Lonza Walkersville Inc.から購入しました。これらはすべて、Lonzaの品質基準を満たしています。ヒトCD34+臍帯血HSCは、Lonza Walkersville Inc.（＃2C-101H）から購入するか、CD34+前駆細胞分離キット（Miltenyi Biotec、Inc.、Auburn、CA、USA）を使用してボランティアから寄付されたヒト臍帯血から分離されました。ヒトMSCは、iScoveの改造されたダルベッコの培地（IMDM、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国）で構成される膨張媒体で培養されました。 μg/mLストレプトマイシン [19]、および2 mm L-グルタミン（Sigma-Aldrich）。ヒトCD34+ HSCは、Dulbeccoの修正されたイーグル媒体（DMEM、Invitrogen、Grand Island、NY、NY、USA）で培養され、BM-MSCについて上記の10％FBSおよび抗生物質を添加しました。台湾保健福祉省（TYGH100040、TYGH109026）および国立健康研究機関の研究倫理委員会（EC1000802、EC1001101-R1、EC1030604-E、EC1030604-E、EC11111003-W）の協会総合審査委員会の承認。
ヒト抗CD3/CD28活性化Tリンパ球の調製
ヒトTリンパ球は、ficollパク密度勾配遠心分離を使用して、臍帯血の自己サンプルから分離されました。その後、CD3+ T細胞をヒトパンT細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を使用して精製し、95％を超える純度を達成しました。次に、精製されたCD3+ T細胞を、さらに使用するために収集する前に、ヒトT活性化CD3/CD28 Dynabeads（Invitrogen）を24時間活性化しました。ヒト免疫細胞を含むすべての手順は、国民健康研究機関の研究倫理委員会の承認されたガイドライン（承認番号：EC1000802、EC1030604-E、EC1111215-W）に準拠して実施されました。
ヒト化されたマウスの生成
CD34+ HSCは、メーカーの指示に従って陽性免疫磁気選択によって分離されました（Miltenyi Biotec、Inc。）。 CD34+ HSC単独（5×104）、HSCS/T細胞（5×104：5×104）、HSCS/MSC（5×104：2×104）、HSC/MSC/T（5×104：2×104：5×104：5×104）を含むさまざまな細胞の組み合わせは、4年前の息子になりました。 RS2000 X線生物照射器（RAD Source Technologies、Inc.、Alpharetta、GA）を使用した、前照射（2000 MGY）。移植後4週間後、血液サンプルを静脈穿刺を介して各ヒトHSC注入マウスから収集し、ヒト特異的表面マーカー（HCD45）の染色またはリアルタイムPCRによるヒトALU信号のスクリーニングのいずれかによって分析されました。
HSC ex vivoの分化とin vivoの再構成
CD34+ HSC（1×105）は、14日間、単独または2×104 BM-MSCおよび1×105の自己活性化T細胞と組み合わせて培養しました。細胞を収集し、抗ヒトCD11B-APC、抗ヒトCD3-PERCP、および抗CD105-PE-シアニン7抗体（BioleGend）で染色し、その後、抗マイエロペロキシダーゼ（MPO） – フィット抗体（Biolegend）を使用した細胞内標識を染色しました。データ分析には、HSC分化細胞としてCD3およびCD105ダブルの陰性細胞を測定することが含まれ、その後FACS分析が行われ、CD11B+ MPO+発現レベルを決定しました。 in vivo HSC再構成分析のために、ヒト化マウスのさまざまな実験群（細胞移植後12〜16週間）の骨髄細胞を収集し、抗ヒトCD45-PE（eBioscience）、抗マウスCD45-APC（BioleGend、San Diego、CA、USA）、および抗Human MPO-FITC Antic Anticを染色しました。 FACS分析は、ヒトCD45+およびヒトMPO発現細胞の頻度を評価するために実施されました。
食作用アッセイ
RNA分離とリアルタイムPCR分析
14日間の共培養後、懸濁細胞を1×DPBS（GIBCO）で3回採取し、3回洗浄しました。 Trizol試薬（Invitrogen）を使用して総RNAを抽出し、製造元の指示に従ってRevertra Aceセット（Toyobo Life Science）を使用してcDNAに変換しました。リアルタイムPCRは、ABI Prism 7900システム（Applied Biosystems）を使用して実行されました。各サンプルについて、サイクルしきい値（CT）値が決定されました。結果は、同じプレート上のGAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のレベルに正規化されました。異なる細胞基のmRNA発現のレベルは、2ΔCT法を使用して計算されました。各遺伝子に固有のプライマーは、次のように設計されました。
Human Gapdh、gagtcaacggatttggtgtcgt（Forward Primer、F）、ttgattttggagggatctcg（Reverse Primer、R）; IL-17 A、CCGCCACTTGGGCTGCATCA（F）、GGGCAGTGTGGAGGCTCCCT（R）; S100カルシウム結合タンパク質A8（S100A8）、GGCAAGTCCGTGGGCATCATGT（F）、CAGGTCATCCCTGTGTAGACGGCA（R）; MPO、GGACCACGGCCTCCCAGGAT（F）、GGTTCCTCAGCACCCGTGCCC（R）; GATA1：AACCGGCACTGACCATGCG（F）、CCTTCGGCTGCTCCTGTGCC（R）; TMF1：aggggagcgaagccgttcct（f）、tcatcgccccctcctcagccg（r）; IL7R：GCACGCTGCCCCCCCTCCATTT（f）、ggctgaccccccagcaactggg（r）; nox2：ctctgaacttggagagaggcaaa（f）、cacagcgtgatgacaactccag（r）; LCN2：ACGGGAGAACCAAGGAGCTGAC（F）、TGGGACAGGGAAGACGATGTGG（R）。
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ELISA）
マウス血清は1日後に収集されました Pseudomonas aeruginosa 感染。次に、メーカーのプロトコル（eBioscience）に従って、市販のELISAキットを使用して、ヒトIL-6およびIL-8レベルを測定しました。
肺感染モデルと細菌CFU評価
肺間質細胞の分離
肺組織の半分を冷たいHBSSですすいで、500 µmのスライスに切断しました。サンプルは、10％FBS、DNase（75 µg/ml; Sigma-Aldrich）、およびコラゲナーゼD（1 mg/ml; Roche）を37°Cで30〜60分間補充したHBSSでインキュベートしました。消化後、得られた細胞懸濁液を滅菌フィルターでろ過し、PBSで洗浄し、抗ヒトCD45-PE（eBioscience）、抗マウスCD45-APC（BioleGend、San Diego、CA、USA）、および抗Human MPO-FITC抗体で染色しました。フローサイトメトリー分析を実施して、ヒトCD45+およびヒトMPO発現細胞の頻度を決定しました。
蛍光活性化細胞ソート（FACS）分析
細胞を採取し、FACS緩衝液（1％FBSを含むPBS）で1回洗浄して、非特異的結合を防止し、氷上で30分間、示された表面マーカーに特異的な蛍光結合抗体で染色しました。インキュベーション後、細胞をFACSバッファーで3回洗浄して、非結合抗体を除去し、再懸濁し、Cytek Aurora Flow Cytomer（Cytek）を使用して分析しました。正確なゲーティングとマーカーの検出を確保するために、適切な補償が含まれていました。データは、内部コントロールに基づいて蛍光信号が調整された、破片と死細胞を除外する標準的なゲーティング戦略に従ってFlowJoソフトウェア（バージョン10.8.0）を使用して分析されました。抗体クローンとその対応するフルオロクロムは、以下にリストされています。抗ヒトCD45-BV421（クローン：Hi30、BioleGend、CAT＃304,032）。抗ヒトCD11B-APC（クローン：M1/70、BioleGend、CAT＃101,212）;抗ヒトCD19-BV510（クローン：SJ25C1、BD Biosciences、CAT＃562,947）;抗ヒトCD3-PERCP（クローン：OKT3、BioleGend、CAT＃317,338）;抗ヒトMPO-FITC（クローン：MPO421-8B2、BioleGend、CAT＃347,201）。
統計分析
すべてのグラフが生成され、統計分析はGraphPad Prism（バージョン5.02および8.0.1）を使用して実行されました。生存率データは、ログランクテストを使用して分析され、mRNA発現データはANOVAに続いてボンフェローニ後のテストを使用して評価されました。との違い p-0.05未満の値は統計的に有意であると見なされました。
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