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2025-02-01 08:16:00
二重リアルタイムRAA用の標準プラスミド
PCV3（2、000 bp）およびPCV4（1、770 bp）の完全なゲノムは、PCV3およびPCV4ゲノムシーケンス（GenBank AccessionNo。KT869077およびMT311852）に従って合成され、Sangon Biotech Co.によるPUC57ベクターにクローン化されました。 Ltd.（Sangon Biotech Co.、Ltd。、Shinghai、China）は、PUC57-PCV3およびPUC57-PCV4として指定された二重鎖リアルタイムRAAアッセイの標準プラスミドを構築します。標準プラスミドの濃度は、NanodropおよびQubit 2.0蛍光計（Thermo Fisher Scientific、MA、USA）を使用して測定しました。 DNAコピー数は、次の式を使用して計算されました。DNAコピー数/µl = [plasmid concentration (ng/µL)×10− 9 × 6.02 × 1023]/[DNA length (nt)×660]。遺伝子シーケンスは、Sangon Biotech Co.、Ltd。（Sangon Biotech Co.、Ltd。、上海、中国）によって処理されました。標準のプラスミドPUC57-PCV3およびPUC57-PCV4は、使用するまで-20℃で保存されました。
プライマーとプローブの設計と合成
GenBankデータベースのPCV3および29株（GenBankデータベースのPCV4の29株（遺伝子型4A、4B、4Cを含む）の30株（遺伝子型3A、3B、3Cを含む）のゲノム配列全体が、それぞれLasergeneバージョン7.1ソフトウェア（Dnastar Inc.、Wi）を使用して整列しました。 、米国）高度に保存された地域を特定する。 Primer Premierバージョン5.0ソフトウェア（米国カリフォルニア州Biosoft Premier Biosoft）を使用して、TwistAmp™増幅ガイドライン（TwistDX Ltd.、Cambridge、UK）で提案されている基準に従ってRAAプライマーとプローブを設計しました。 NCBIプライマーブラストWebツールを使用して、プライマーペアとプローブの設計のためのシリコチェックを実施しました（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）。 PCV3とPCV4を検出する二重リアルタイムRAAアッセイの開発のために、2つのプライマーペアと2つのRAAプローブがPCV3のORF2遺伝子を標的とするように設計されました（図1）。同時に、3つのプライマーペアと2つのRAAプローブが、PCV4のORF1またはORF2遺伝子を標的とするように設計されました（図2および3）。この研究の二重リアルタイムRAAのプライマーとプローブの詳細を表1に示します。すべてのプライマーとプローブは、Sangon Biotech Co.、Ltd。（Sangon Biotech Co.、Ltd.、Shanghai、China）によって合成されました。
図1
GenBankデータベースの異なるPCV3株のORF2（CAP遺伝子）シーケンスの二重リアルタイムRAAプライマーとプローブの位置。ドットは、大部分に一致するヌクレオチド残基を表しています。前方プライマーには赤いバーがマークされ、リバースプライマーには青いバーがマークされ、プローブは緑色のバーでマークされています
図2
GenBankデータベースの異なるPCV4株のORF1（REP遺伝子）シーケンスの二重リアルタイムRAAプライマーとプローブの位置。ドットは、大部分に一致するヌクレオチド残基を表しています。前方プライマーには赤いバーがマークされ、リバースプライマーには青いバーがマークされ、プローブは緑色のバーでマークされています
図3
DuplexリアルタイムRAAプライマーの位置と、GenBankデータベースの異なるPCV4株のORF2（CAP遺伝子）シーケンスのプローブ。ドットは、大部分に一致するヌクレオチド残基を表しています。前方プライマーには赤いバーがマークされ、リバースプライマーには青いバーがマークされ、プローブは緑色のバーでマークされています
表1デュプレックスRAAに使用されるプライマーとプローブ
二重リアルタイムRAAアッセイ
デュプレックスリアルタイムのRAAアッセイの反応混合物は、商用プローブベースのRAAキット（Hangzhou Zhongce Biotechnology Co.、Ltd.、Hangzhou、China）を使用して調製しました。反応混合物（50 µL反応容量）には、バッファーA（25 µL）、PCV3およびPCV4前方プライマーおよびリバースプライマー（10 µM）、それぞれ0.6 µL PCV3およびPCV4プローブ（10 µM）、テンプレートDNA（5 5 l）が含まれていました（5 µL）、ヌクレアーゼを含まない水（8.3 µL）およびバッファーB（2.5 µL）。簡単に言えば、テンプレートDNAとバッファーBを除く成分を前処理し、Raa酵素ドライパウダーを含む反応チューブに移し、完全に混合して転覆しました。 5 µLのテンプレートDNAを反応チューブに加え、2.5 µLのバッファーBをチューブの蓋にピペットします。短い渦の混合と遠心分離の後、反応混合物を含む反応チューブをVIIA™7リアルタイムPCR機器（Thermo Fisher Scientific、MA、USA）に即座に配置し、39°Cで約20分間（1サイクル）インキュベートしました。 39°Cで40秒、39°Cで30秒間40サイクル）。蛍光信号はリアルタイムで監視され、30秒ごとに収集されました。 20分以内の陰性対照しきい値を上回る指数関数的増幅曲線を生み出したサンプルは、陽性と判断されました。
反応システムの最適化
最適化実験を実施して、最適な二重リアルタイムRAAシステムを決定しました。最適化実験では、2.5 µL標準プラスミドPUC57-PCV3（20.0 ng/µL）および2.5 µL標準プラスミドPUC57-PCV4（20.0 ng/µL）を混合して、反応システムのテンプレートとして機能させました。 6セットのプライマープローブの組み合わせ（PCV3 F1R1 P1/PCV4 F1R1 P1、PCV3 F1R1 P1/PCV4 F2R2 P1、PCV3 F1R1 P1/PCV4 F3R3 P2、PCV3 F2R2 P2/PCV4 F1R1 P1、PCV3 F22 PP2/PP2/PP2/PP2/PCV4 F2/ P2/PCV4 F3R3 P2）は、最適なプローブとプライマーの組み合わせを決定するために、キットマニュアルが推奨する反応条件下で市販のプローブベースのRAAキットを使用してスクリーニングしました。
最適なパフォーマンスのプライマープローブの組み合わせの濃度は、単一の可変成分の濃度を設定することによりさらに最適化され、他のすべての条件はキットマニュアルで推奨されているように固定されました。プライマーペア濃度を200、400、および600 nmに希釈し、濃度の組み合わせを表2に掲載しました。プローブ濃度勾配は60、90、120、150、180 nmに設定しました。
表2 PCV3およびPCV4プライマーペア濃度比
核酸抽出
製造業者の指示に従って、臨床サンプルおよび人為的にスパイクされたサンプルのウイルス核酸と人為的にスパイクされたサンプルを200 µLのサンプル溶解物から抽出しました（Roche Diagnostics、NJ、NJ、NJ、USA）。抽出された核酸を50 µLのヌクレアーゼを含まない水で溶出し、二重リアルタイムRAAアッセイとQPCRアッセイに使用するまで-80℃で保存しました。製造業者の指示に従って、プラスミドミニキット（Sangon Biotech Co.、Shanghai、Ltd.、Ltd.、Ltd.、Ltd.）を使用して、DuplexリアルタイムRAA用のPCV3およびPCV4の標準プラスミドを抽出しました。
分析特異性
PCV3およびPCV4検出の二重鎖リアルタイムRAAアッセイの特異性は、最適な反応システムと条件下で、他の重要な豚病原体および標準プラスミド（PUC57-PCV3およびPUC57-PCV4）のウイルスDNAまたはcDNAを使用して評価されました。豚の病原体にはFMDVが含まれていました（足と口の病気のウイルス）、csfv（古典的なブタ熱ウイルス）、PRV（擬似ラビウイルス）、PPV（ブタのパルボウイルス）、PCV2（ブタカコビ2）、pedv（ブタの流行下痢ウイルス）、tgev（伝染性胃腸炎ウイルス）、prrsv（ブタの生殖および呼吸器症候群ウイルス）、およびpdcov（ブタ・デルタコロナウイルス）。上記の9つのウイルス性病原体のウイルス核酸が抽出され、私たちの研究室で維持されました。製造業者の指示によると、ウイルスcDNAはPrimescript™cDNA合成キット（Takara Biomedical Technology Co.、Ltd.、Dalian、China）を使用して取得しました。
分析感度
PCV3およびPCV4の二重リアルタイムRAAアッセイの感度を評価するために、標準的なプラスミド（PUC57-PCV3およびPUC57-PCV4）を2.5 µLあたり107〜100コピーの10倍の連続希釈にかけました。各希釈は、最適化されたシステムに従って二重リアルタイムRAAアッセイを実行するためのテンプレートとして使用されました。検出限界をより正確に分析するために、上記の希釈シリーズを使用して8つの独立した実行を実行し、SPSS 24.0ソフトウェア（SPSS Inc（SPSS Inc）を使用したプロビット回帰分析による95％の検出限界（LOD）の計算にデータが使用されました。 。、シカゴ、イリノイ州、米国）。
再現性と再現性の分析
標準プラスミド（PUC57-PCV3およびPUC57-PCV4）の3つの異なる希釈液（104、103、および102コピー）を、標準プラスミドのテンプレート（PUC57-PCV3およびPUC57-PCV4）として使用して、アセイ内を評価しました。再現性とアッセイ間再現性。各反応システムでは、テンプレートは2.5 µLの希釈PUC57-PCV3と希釈PUC57-PCV4 2.5 µLで構成され、両方とも同じ濃度で構成されていました。各希釈反応は、1回の実行または別の日に3回の独立した実行で3回テストされました。変動係数（CVS）は、サイクルしきい値（CT）を計算することにより得られました。
臨床サンプルと人為的にスパイクされたサンプルの検出
PCV3およびPCV4の二重リアルタイムRAAアッセイの臨床性能を評価するために、60のサンプル（55の臨床サンプルと5つの人為的にスパイクされたサンプル）を準備して、開発されたアッセイによる検出を準備しました。 55の臨床サンプルをPCV3 QPCRアッセイ（中国の局所基準に従って）とそれぞれ以前に報告したPCV4 QPCRアッセイを使用してスクリーニングしました [6]、および結果は、PCV4のQPCR陽性サンプルを示さなかった。したがって、PCV4（PUC57-PCV4）の標準プラスミドを、それぞれPCV3と5つの人為的にスパイクしたサンプルの3つのQPCR陽性サンプルと混合しました。具体的には、50 µLのPUC57-PCV4（205.8 ng/µL）を、PCV3に対してQPCR陽性をテストした1 g、2 g、および2.6 gのリンパ節サンプルと個別に混合しました。人為的にスパイクされたサンプルでは、50 µLのPUC57-PCV4（205.8 ng/µL）も2 g、3.5 g、および5 gの豚肉、および1.5 gおよび2 gのリンパ節サンプルと個別に混合しました。ウイルス核酸をこれらの各混合物から抽出し、使用前に-20°Cで保存しました。比較のために、それぞれPCV3およびPCV4 QPCRアッセイを使用して、60のサンプルも並行して検出されました。
統計分析
Kappa統計を適用して、SPSS 24.0ソフトウェア（SPSS Inc.、Chicago、IL、USA）を使用して、二重鎖リアルタイムRAAアッセイとQPCRアッセイの間の一致率を比較しました。統計分析とデータプロットは、GraphPad Prismソフトウェア（La Jolla、CA、USA）を使用して実行されました。
#Duplexリアルタイムリコンビナーゼの開発PCV3とPCV4の同時かつ迅速な検出のための支援増幅アッセイ #Virology #Journal