1。はじめに
SARS-COV-2の新しいバリアントは、グローバルなCovid-19の発生の開始以来、継続的に出現しています。これらのバリアントは、伝播の増加、抗体回避の強化、ワクチンと治療の有効性の低下の可能性を秘めています [1,2]。オミクロンバリアント（パンゴ系統b.1.1.529）は、2021年11月に南アフリカで最初に報告され、2021年12月末までに、米国で最も一般的なバリアントとしてデルタをすぐに追い越しました。 [3,4]。それ以来、オミクロンのバリエーションは、世界中で監視下（VUM）の下での関心のある主要な循環バリアント（VOI）とバリアントとなっています [5,6]SARS-COV-2の新たなバリアントを治療するための効果的な治療法が必要です。 Remdesivir（RDV; GS-5734;veklury®）は、入院および非依存性のある成人および小児患者のCOVID-19を治療するために承認された静脈内投与ヌクレオチド類似体プロドラッグです。 [7]。 Obeldesivir（ODV; GS-5245）は、RDVの親ヌクレオシドの経口プロドラッグであり、制限された薬物と薬物の相互作用を伴う単純な2回の1日の治療レジメンになる可能性があります [8,9]。異なる代謝経路を使用して、RDVとODVは、プライマー鎖に共有結合して組み込まれることにより、SARS-COV-2 RNA依存性RNAポリメラーゼ（NSP12）の阻害剤として作用する同じ活性ヌクレオシドトリリン酸（NTP）を生成します。その結果、テンプレート依存性阻害が生じます [9,10,11]。 RDVの決定的な特徴は、広範囲のウイルスに対する有効性です [12,13,14,15,16,17,18,19,20]; ODVは同様の抗ウイルスプロファイルを示しています [9,12,21,22]新しいSARS-COV-2バリアントが検出されると、ゲノム監視は、既存の治療薬に対する耐性を与える可能性のある緊急変異を監視する上で重要な役割を果たします。オミクロンバリアントは、スパイクタンパク質の30を超えるアミノ酸置換によって特徴付けられ、治療的モノクローナル抗体の有効性に影響を与えます [23]。例として、OmicronバリアントBF.7、BQ.1、XBF、XBB.1.5、およびCh.1.1は、以前に検出された変異体と比較してより大きな抗体脱出を示し、さまざまなモノクローナル抗体はオミクロンバリアントXBB.1.16を中和することができませんでした。およびXBB.1.9.1 [24,25,26,27]。その結果、これらおよび他の循環サブリーニージに対する保護を改善するために、ワクチンが更新されました [28,29,30]。より最近では、祖先のバリアントBa.2と比較して、スパイクタンパク質に30を超える変異があるオミクロンバリアントBa.2.86の出現は、世界的な懸念を引き起こしました [31]。 Ba.2.86は、現在流通しているJN.1サブリネージに急速に進化しました [32]、サブバリアントKP.2、KP.3、およびLB.1が含まれます [33]。これらのバリアントは、効果的な免疫回避を示しています [32,33,34]、2024年から2025年のワクチン組成を更新するための推奨事項を促して、JN.1をターゲットにします [35]。 RDVとODVは、スパイクタンパク質と比較して遺伝的進化が最小限である保存されたRNA依存RNAポリメラーゼ領域を標的としています。 [36,37]、COVID-19の治療と発達における継続的な使用をサポートするために、SARS-COV-2バリアントに対する残りの効力を確認することが重要です。ここでは、臨床分離株を使用した最近のオミクロンバリアントに対するRDVおよびODVの抗ウイルス活性を評価するか、レプリコンシステムにレプリケーション複合体に存在するバリアント定義置換を導入します。さらに、公共データベースで観察されたNSP12多型に対するRDVおよびODVの抗ウイルス活性がレプリコンシステムで評価されました。
2。材料と方法
OmicronバリアントBa.2.86、Bf.7、Bq.1、Ch.1.1、Eg.1.2、Eg.5.1、Eg.5.1.4、Fl.22、HKにに対するRDVおよびODVのin vitro抗ウイルス活性を評価する.3、HV.1、JN.1、XBB.1.5、XBB.1.5.72、XBB.1.16、XBB.2.3.2、XBC.1.6、およびXBF、以前に記載されたSARS-COV-2抗核タンパク質酵素酵素酵素-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）は、A549-HACE2-TMPRSS2細胞（A549-HACE2TPSA; Invivogen、サンディエゴ、カリフォルニア州カリフォルニア州）で利用されました。 [9,38]。 100 µLのダルベッコの修飾イーグル培地（DMEM; 10％胎児ウシ血清が補充された合計3×104 A549-HACE2-TMPRSS2細胞） [FBS] 1×ペニシリン – スレプトマイシン）を96ウェルプレートの各井戸に播種し、一晩インキュベートしました。翌日、培地を吸引し、2％FBSを含む100 µLのDMEMを各ウェルに加えました。 3回、RDV（5–0.002 µm）またはODV（50〜0.02 µm）の3倍の連続希釈液を各ウェルに加えて、200 µL/ウェルの最終容量を加えました。化合物の添加直後、細胞を2％FBSを添加した100 µLのDMEMで希釈した関連するSARS-COV-2バリアントの1.5×103プラーク形成単位を感染させ、0.05の多重度感染をもたらしました。プレートを500×gで1分間遠心分離し、37°Cで5％CO2で3日間インキュベートし、その後培地を吸引し、細胞を室温（RT）で10分間100％メタノールで固定しました。メタノールを除去し、プレートをRTで10分間風乾した後、100µl/ウェルのブロッキングバッファー（リン酸緩衝生理食塩水と1時間のインキュベーションを行いました。 [PBS] 10％FBS、5％非脂肪乾燥牛乳、および0.1％トゥイーン20）で、37°Cで1時間。その後、ブロッキングバッファーを吸引し、ウサギ抗SARS-COV-2ヌクレオカプシド抗体の1：10,000希釈（MA5-36086）を吸引しました。 [4Z6T2];ブロッキングバッファー中のInvitrogen、Waltham、MA、USA）を加え、37°Cで2時間インキュベートしました。プレートは、50 µL/ウェルの西洋ワサイッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG（GTXRB-003-FHRPX; Immununoreagents、NC、NC、NC、USA）を添加する前に、0.1％Tween 20を含む200 µL/ウェルのPBSで4回洗浄しました。ブロッキングバッファーで1：4000を希釈しました。プレートを再び37°Cで1時間インキュベートした後、0.1％Tween 20で200 µL PBSで4回洗浄しました。 、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を各ウェルに加え、陽性コントロールウェルの可視染色、通常は5〜10分までRTでインキュベートすることを許可しました。反応は、100 µL/ウェルのTMB STOP溶液（5150-0021; Seracare、Milford、MA、USA）を添加して停止しました。次に、Envisionプレートリーダーを使用して、吸光度を450 nmで読み取りました。
半最大有効濃度（EC50）値は、DMSOのみ（0％阻害）および感染していない感染細胞と比較して、核タンパク質発現（ELISA）またはルシフェラーゼシグナル（レプリコン）が50％減少した化合物濃度として定義されました。対照細胞（100％阻害）。 RDVおよびODV EC50値は、非線形回帰を使用して曲線適合から計算されました（GraphPad Prism v8.1.2）。関連するWA1参照との比較のために、バリアントのEC50フォールド変化を各実験で計算しました。次に、すべての実験にわたる折りたたみ変化を平均して、最終報告値を取得しました。各臨床分離株について、技術的な3回で実験を実施しました。 ELISAアッセイの変動性は、野生型参照の繰り返しテスト後に推定されました（RDV、n = 40; ODV、n = 11）。野生型臨床分離株のRDV EC50値は、44.2 nmから196.8 nm（平均、112.1 nm、中央値、103.4 nm、標準偏差、35.2 nm）の範囲でした。これらのデータに基づいて、アッセイの変動性は2.8倍であると推定しました。野生型臨床分離株のODV EC50値は、1.43 µmから4.17 µm（平均、2.29 µm、中央値、2.11 µm、標準偏差、0.75）の範囲でした。これらのデータに基づいて、アッセイの変動性は2.9倍であると推定しました。野生型参照の繰り返しテスト（RDV、n = 44; ODV、n = 36）の繰り返しテスト後に、サブ遺伝子レプリコンアッセイの変動性も推定されました。野生型レプリコンのRDV EC50値は、3.7 nmから30.8 nm（平均、11.3 nm、中央値、10.1 nm、標準偏差、4.6 nm）の範囲でした。推定アッセイの変動は2.5倍でした。野生型レプリコンのODV EC50値は、0.38 µmから0.97 µm（平均、0.62 µm、中央値、0.61 µm、標準偏差、0.14 µm）の範囲でした。推定アッセイの変動は2.3倍でした。したがって、RDVまたはODVのそれぞれのしきい値を下回る倍率変化値を持つバリアントは、アッセイのばらつき内にあります。
OmicronバリアントJN.1.7、Jn.1.18、Kp.2、Kp.3、およびLb.1の場合、臨床分離株は入手できませんでした。したがって、非感染性SARS-COV-2レプリコンシステム（SARS-COV-2 SH01、SARS-COV-2/Human/CHN/SH01/2020、GenBank MT121215から分離された4つのDNAフラグメント）を使用して、RDVおよびODV抗ウイルス活性を評価しました。 。確立されたレプリコン法は以前に説明されています [39] SARS-COV-2サイト指向変異体の表現型分析に使用されます複雑なコンポーネント [40,41]。簡単に言えば、複製複合遺伝子（NSP8からNSP14）で特定されたバリアント定義の置換をルシフェラーゼを発現するレプリコンに導入し、レプリコンをエレクトロポレーションによりHUH7-1CN細胞にトランスフェクトし、細胞を4倍の平行希釈液で処理しました。 RDV（8希釈合計、10 µm – 0.6 nm）またはODV（8希釈液の合計、200 µm〜12 nm）。 48時間後、細胞上清を収集し、ルシフェラーゼシグナルを測定して、非線形回帰を使用して各化合物のEC50値を決定しました（GraphPad Prism v8.1.2）。技術的な3回の3回で2つの実験が行われました。
環境インフルエンザデータEpicovデータベースを共有するグローバルイニシアチブの懸念、VOI、またはVUMS、SARS-COV-2シーケンスのオミクロンバリアントで観察されるNSP12多型（シーケンスの1％以上）の有病率を評価するために評価されました。 RDVおよびODVの抗ウイルス活性に対するNSP12多型の影響を評価するために、特定されたNSP12多型を持つ部位指向変異体を、上記の同じレプリコンシステムを使用して評価しました。
同定された多型の構造分析は、構造バイオインフォマティクスプロテインデータバンク（ID＃：6xezおよび7UO4）の研究協力から回収された複製転写複合体の凍結電子顕微鏡構造の複合モデルで実施されました。 [42,43]。
4。議論
2024年5月以来、米国は、テスト陽性、入院、および死亡率の増加を含む、Covid-19活動の増加を観察しています。 [5]。この復活は、主にKP.2やKP.3を含む最新のSARS-COV-2オミクロンバリアントによって駆動されます。 [5]、さらに深刻なバリエーションが近づいている可能性があるという懸念が高まっています。関連する公衆衛生上の課題の中で、新しいバリアントの継続的な出現は、抗ウイルス薬に対する感受性の変化の潜在的なリスクをもたらします。したがって、持続的な治療効果を確保するために、RDVなどの広く使用されている抗ウイルス療法に対する新しいバリアントの感受性を継続的にテストすることが重要です。
この分析では、最近のSARS-Cov-2オミクロン亜変性に対する親ヌクレオシドの経口プロドラッグであるRDVおよびODVのin vitro抗ウイルス活性が評価されました。 RDVとODVは、祖先の参照に対してテストされたときに観察されたものと同等の効力を備えた、テストされたすべてのオミクロンバリアントに対する活動を維持しました。同様に同定された29のNSP12多型の表現型は、同様に、SH01参照株と比較してRDVまたはODV抗ウイルス活性の変化を示しませんでした。
これらの結果は、ここで分析されたものとは異なる複数のオミクロンバリアントが両方の化合物に影響を受けたままである以前の分析と一致しています。 [9,38]。一緒に、これらの発見は、オミクロン変異体の文脈でのCovid-19の治療のためにRDVの継続的な使用をサポートしています。
#RemdesivirとObeldesivirはSARSCOV2オミクロンバリアントに対する強力な抗ウイルス活性を保持しています