1731903560
2024-11-18 04:12:00
eVLP とは何ですか?
高分子を細胞内に効率的かつ安全に送達する能力 インビトロ そして 生きている さまざまな新しい治療法にとって重要です。アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターは遺伝子編集物質の送達に成功しますが、 生きている、それらにはいくつかの制限が伴います。
したがって、これらの制限を克服するには追加の配信方法が必要です。 VLP は、カーゴメッセンジャーリボ核酸 (mRNA)、タンパク質、またはリボ核タンパク質 (RNP) をパッケージ化して送達するウイルスの足場を構成します。 VLP は、効率的な形質導入、組織指向性、オフターゲット編集の軽減、および一過性のカーゴ発現を提供します。
研究結果
研究者らは、eVLP 用の直接実験室進化システムを開発しました。当初、eVLP バリアントの正体は、バーコード付きシングルガイド RNA (sgRNA) を使用して解明され、特定の特性を持つ望ましいバリアントの選択が可能になりました。その後、バーコード化された sgRNA と機能的な eVLP 産生との適合性が開発され、その後 15 塩基対のバーコード配列が sgRNA 足場のテトラループに挿入されました。
検証実験には、活性アデニン BE (ABE) RNP カーゴをパッケージ化した第 4 世代 (v4) ベースエディター (BE)-eVLP が使用されました。標準 v4 BE-eVLP は、Gag-ABE 融合、モロニーマウス白血病ウイルス (MMLV) Gag-Pro-Pol ポリタンパク質、水疱性口内炎ウイルス G エンベロープタンパク質、および sgRNA をコードする 4 つのプラスミドをプロデューサー細胞に同時トランスフェクトすることによって生成されました。 -ターゲットベースの編集。
その後、テトラループまたは任意に選択された 4 つのバーコードを持つ標準バーコード化 sgRNA を含む v4 eVLP を生成し、塩基編集効率を測定することによって比較しました。バーコード化された eVLP は標準 eVLP に匹敵する効力を示すことが判明しましたが、別個のバーコード化された sgRNA を備えた eVLP は同等の効力を有しました。さらに、Gag-ABE 融合を欠く eVLP は、標準的な v4 eVLP よりも 216 倍少ない sgRNA をパッケージングしました。
追加の実験では、バーコード化された sgRNA を使用して別個の eVLP 変異体を標識できること、および選択後に濃縮されたバーコードにより適合性が向上した変異体を識別できることが示されました。
次に、この進化システムを適用して、改良された特徴を持つキャプシドを突然変異させて選択しました。この目的を達成するために、Gag-ABE カーゴ内の MMLV Gag タンパク質キャプシドおよびヌクレオカプシド ドメインの 3,762 個の単一残基変異体を含むバーコード付き eVLP キャプシド ライブラリーを生成しました。
このバーコード化されたライブラリーを使用して、バーコード化された eVLP プロデューサー細胞のライブラリーを構築しました。プロデューサー細胞のレンチウイルス形質導入とそれに続く形質導入された細胞の増殖により、単一のバーコード – キャプシド変異体ペアを持つプロデューサー細胞の画分が増幅されました。
バーコード化された eVLP キャプシド ライブラリーは、プロデューサー細胞からの生産と HEK293T 細胞の形質導入をそれぞれ改善するために 2 つの選択を受けました。この目的を達成するために、バーコード化プロデューサー細胞ライブラリーから eVLP 生成を開始し、その結果得られたキャプシド変異体のライブラリーを精製しました。
その後、eVLP パッケージ化 sgRNA が単離され、この生成選択後に存在するバーコードが配列されました。各バーコード配列について eVLP 生成の濃縮を推定し、標準 eVLP カプシドと比較して濃縮が増加したバーコードを特定しました。ライブラリー内のキャプシド変異体の約 8% は、標準 eVLP キャプシドよりも高い生産濃縮を示しました。
HEK293T 細胞を、精製されたバーコード付き eVLP キャプシド ライブラリーとインキュベートしました。 6 時間後、標的細胞に形質導入された sgRNA が単離され、各バーコード配列の eVLP 形質導入濃縮度が計算されました。
すべてのキャプシド変異体のうち、標準的な v4 eVLP キャプシドよりも高い平均形質導入濃縮度を持っていたのはわずか 0.7% でした。ほとんどのキャプシド変異体は、標準的な v4 eVLP キャプシドよりも形質導入および生産効率が劣っていましたが、生産または形質導入において改善を示した変異体は存在しませんでした。このため、別個の競合する機構がそれらの効率に影響を与えることが示唆されています。
いくつかの変異体を、ポジティブな産生または形質導入選択の濃縮に基づいてさらなる分析のために選択した。一方の特性を損なわずに他方の特性を改善した変異体が優先されました。
Gag-ABE 構築物にキャプシド変異を導入しても、効力は増加しませんでした。これにより、研究者らは、Gag-Pro-Pol コンストラクト (GagQ226P-Pro-Pol) での生産選択において最も強力に強化された、Q226P 変異を含む Gag-ABE コンストラクトのキャプシド変異体の効力を評価することになりました。
さまざまなキャプシド変異体は、v4 eVLP と比較して BE 送達能力を最大 3 倍増加させました。 C507V、C507F、A505W、D502Q、R501I を含む 5 つの変異が最も高い効力を持っていました。しかし、1 つの変異体の組み合わせである GagC507V-ABE と GagQ226P-Pro-Pol は効力が 3.7 倍向上し、第 5 世代 (v5) BE-eVLP と指定されました。
v4 BE-eVLP と v5 BE-eVLP の効力を比較したところ、v5 BE-eVLP は v4 BE-eVLP よりも有意に高い塩基編集効率を有し、より強力であることが示されました。興味深いことに、v4 BE-eVLP で達成される最大の編集効率は、16 倍低い用量の v5 BE-eVLP で達成されました。
結論
参考雑誌:
- ラグラム A.、アン M.、チェン PZ、リュー DR (2024)。生産効率と形質導入効率が向上した、操作されたウイルス様粒子の進化を指向します。 ネイチャーバイオテクノロジー。 土井:10.1038/s41587-024-02467-x
#操作されたウイルス様粒子が進化して優れた遺伝子送達効率を実現