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2024-10-21 18:44:00
細菌分離株
本研究では、2022年2月から5月にかけて、重複しないカルバペネム耐性の臨床分離株30株が検出された。 緑膿菌 イラン、ケルマーンのアフザリプール病院内病棟の入院患者の気管支肺胞洗浄液（BAL）から採取された。分離株は次のように特定されました 緑膿菌 グラム染色、オキシダーゼ試験、マッコンキーおよび三糖鉄寒天 (TSI) での非炭水化物発酵、ピッグマン生産、酸化発酵 (O/F) 試験、セトリミド寒天での増殖、42 °C での生化学的試験を使用します。同定後、分離株はさらなる調査のために、20% グリセロールを含むトリプシン大豆ブロス (TSB) に -80 °C で保存されました。 [16]。この研究におけるすべての培地は、CONDA (Condalab Co.、スペイン) または HiMedia (Himedia Laboratories Pvt. Ltd.、インド) から提供されました。
抗菌剤感受性試験
分離株の抗菌剤感受性は、Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI、M100; 2022) の推奨事項に従って決定されました。 [17]。ディスク拡散法は、メロペネム (MEM、10 μg)、イミペネム (IPM、10 μg)、セフェピム (FEP、30 μg) を含むいくつかのクラスの抗生物質 (PADTAN TEB Co.、イラン) に対する分離株の抗菌感受性を評価するために使用されました。 )、セフタジジム (CAZ、30 μg)、ゲンタマイシン (GEN、10 μg)、トブラマイシン (TOB、10 μg)、およびシプロフロキサシン (CIP、5 μg)。 125、250、500 μg/mL のクロキサシリン (CLX; Farabi Pharmaceutical Co.) の有無による、IPM、MEM、CAZ、および FEP (Jaber Ebne Hayyan Pharmaceutical Co.、テヘラン、イラン) に対する分離株の最小発育阻止濃度 (MIC) 、イスファハーン、イラン）は、AmpC 過剰生産菌分離株の検出に使用されました。 CAZのMIC、またはIPM、MEM、およびFEPの1つとCLXの間で少なくとも2倍の希釈低下があった場合、分離株はAmpC過剰生産株とみなされました。 [16, 18]。 緑膿菌 ATCC 27853 および 大腸菌 ATCC 25922 は抗菌薬感受性試験の標準株として使用されました。
バイオフィルム生成アッセイ
CLX の有無による IPM、MEM、FEP、および CAZ への分離株の MBIC の決定
分離株中の 250、500、1000、および 2000 μg/mL の CLX の有無による IPM、MEM、CAZ、および FEP に対する分離株の最小バイオフィルム阻害濃度 (MBIC) を、96 ウェル ポリスチレン プレート上でブロス微量希釈法を使用して決定しました。平底のマイクロプレート形状です。簡単に言うと、1 × 106 CFU/mL の接種材料を含む細菌分離株の懸濁液を、定数の有無にかかわらず、CAZ、FEP、IPM、および MEM の一連の希釈液を加えた 1% グルコースを加えたトリプシン大豆ブロスで希釈しました。 CLX のサブ MIC のいずれかの濃度 (250、500、1000、および 2000 μg/mL) を加え、37 °C でインキュベートしました。 24 時間のインキュベーション後、CLX の有無にかかわらず最低濃度の抗生物質でサフラニン染色を使用して MBIC レベルを決定しました。その結果、OD490nm の差は 3 つの陽性増殖コントロールウェル読み取り値の平均の 10% 以下となりました。 [20]。
PCR によるカルバペネマーゼおよび 16S rRNA メチラーゼ遺伝子の検出
ゲノムDNA抽出には煮沸法を採用 [21]。 PCR は、10 µL の 2X Taq DNA Polymerase Master Mix RED (AMPLIQON, Co., Denmark)、0.25 µL の各プライマー (Forward および Revers プライマー)、1 µL の DNA テンプレート、および 8.5 µL を含む 20 µL の反応液で実行されました。カルバペネマーゼ遺伝子の検出のための、サーマルサイクラー (バイオメトラ社、ドイツ) での DNase および RNase フリーの滅菌水 (Tehran Cavosh Clon, Co.、イラン) ブラインプ、 ブラヴィム、 ブラSIM、 ブラSPM、 ブラジム、 ブラKPC、 ブラGES、 ブラNDM、および 16S rRNA メチラーゼ。 rmtA、 rmtB、 rmtC、 そして 腕A。プライマー配列、アニーリング温度、および PCR 条件を表 1 に示します。 [12, 15]。 PCR産物を、0.25×トリス-EDTA-ホウ酸緩衝液（TBE、Tehran Cavosh Clon、イラン）中4μLの安全なDNA染色色素（Pars tous Biotechnology、イラン）を含む1％アガロースゲルで電気泳動した。 。
表 1 PCR および qPCR で使用されるプライマーの配列
qPCRによる遺伝子発現実験
の転写レベルは、 動く、 作戦、 そして アンプC 分離株の遺伝子は、相対qPCRを使用した標準曲線法によって決定されました。の rpoD の転写レベルを正規化するための参照遺伝子と考えられました。 動く、 作戦、 そして アンプC Pfaffl 式を使用して標的遺伝子として計算します。臨床分離株では、RNA レベルがキャリブレーター (参照株) としての PAO1 のレベルよりも少なくとも 2 倍低いか高い場合、遺伝子はダウンレギュレートまたはアップレギュレートされました。簡単に説明すると、臨床分離株を 10 mL TSB 培地 (Condalab Co.、スペイン) 内で 37 °C、180 rpm のシェーカー インキュベーター内で対数期 (600 nm での光学密度) まで個別に増殖させました。[OD 600]= 0.8–1)、12,000 rpm で 5 分間遠心分離して細菌細胞を収集しました。分離株の全 RNA を TRIzol (ASAGENE, Co., Iran) を使用して抽出しました。残留およびDNA汚染は、RNase-Free DNase I (SinaClon, Co., Iran)で処理することによって除去され、製造業者の推奨に従ってTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (AddBio, Co., Korea)を使用してcDNAを合成した。 。 qPCR 実験は、RealQ Plus 2x Master Mix Green (AMPLIQON, Co., Denmark) で StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems, Co., USA) を使用し、ネガティブコントロールとポジティブコントロールの両方を 20 個の量で 3 回実行しました。 10 µL RealQ Plus 2x Master Mix Green、0.5 µL cDNA、0.5 µL の各プライマー、および 8.5 µL DNase および RNase フリーの滅菌水 (Tehran Cavosh Clon, Co.、イラン) を含む µL。この研究におけるプライマー配列、アニーリング温度、および qPCR 条件を表 1 に示します。 [7, 15, 22]。
ERIC-PCRによる分子タイピング
Stehling の記載に従って、ERIC1 (5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′) および ERIC2 プライマー (5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC-3′) を使用して ERIC-PCR を実行しました。
他。 [23]。 ERIC-PCR は、25 μL の 2X Taq DNA ポリメラーゼ マスター ミックス RED (AMPLIQON, Co., Denmark)、1 μL の各プライマー、2 μL の DNA テンプレート、および 21 μL DNase および RNaseサーマルサイクラー (Biometra, Co., Germany) 内の無料滅菌水 (Tehran Cavosh Clon, Co., イラン)。 PCR増幅は、DNA変性のために95℃で5分間、アニーリングのために95℃で60秒間、56℃で60秒間35サイクル、および72℃で4分間、最後に72℃で伸長を行った。 10分PCR産物は、TBE 0.5x中の1%アガロースゲルでの電気泳動によって分離され、ゲルはDice + UPGMA分析によって0.2%距離で分析されました。 分離株の識別、クラスターの定義、樹状図の解釈に使用されます。
の統計分析 結果
結果の統計分析には、GraphPad Prism 8 ソフトウェア (GraphPad Software Inc.、米国) を使用しました。両側スチューデント t 検定および ANOVA 検定を使用して、次の転写レベルを評価しました。 動く、 作戦、 そして アンプC と比べて 緑膿菌 PAO1をキャリブレーターとして使用します。 MIC および MBIC については、最初にコルモゴロフ-スミルノフ検定を使用してすべてのデータの正規性が評価されました。結果は正規分布することがわかりました (pKS テストで > 0.05）、一元配置 ANOVA テストを使用して分析し、平均値 ± 標準（平均 ± SEM）として表しました。次に、Tukey の事後検定を使用してグループ間のペアワイズ比較を行い、主効果が ANOVA 検定で見られました。正規分布していないデータ (pp ≤ 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。
#緑膿菌におけるカルバペネムおよびアミノグリコシドに対する重大な耐性イランのケルマーンにおける固有の耐性機構を持つ分離株を保有するblaNDM16SメチラーゼarmAの蔓延 #BMC感染症