BBD分析
RDV-NLC を準備するために BBD に使用された独立変数の選択レベルは、X1 では 1、5.5、10%、X2 では 1、3、5%、X3 では 1、2.5、4 時間でした。さらに、従属変数 (応答) に選択された目標は、Y1 と Y2 を最小化し、Y3 と Y4 を最大化することでした。表 1 に示すように、設計は 15 回の実験実行で構成されていました。表 1 は、RDV-NLC 製剤の最適化のために BBD で観察された応答を示しています。
表 1 RDV-NLC 処方の最適化のための BBD 設計で観察された応答。
多項式はDesign-Expertソフトウェアによって作成され、因子と観察された応答の間の数学的なつながりを示し、2つの条件を考慮してANOVAによってその重要性がチェックされました。まず、適合の欠如がモデルに十分適合していると見なされます。 p値が0.1より大きい場合、つまり有意ではない。第二に、各独立因子の有効性は、効果がゼロでない場合、そしてその効果が p-値は
この設計では、Y1、Y2、Y3、Y4 を分析するための最も適切なモデルは、それぞれ 2 次モデル、線形モデル、2 因子相互作用モデル、2 次モデルであることが示唆されました。モデル項はすべての応答に対して有意でしたが、適合の欠如は有意ではなかったため、モデル適合の妥当性が証明されました。
独立変数が従属因子に与える影響の推定値、その有意水準、および関連する p応答の値は表 1 と表 2 に示されています。示されているように、モデル項はすべての応答に対して有意ですが、適合の欠如は有意ではないため、モデルの適合が適切であることが証明されています。
表2 要因の推定効果と関連 p– 応答の値。
粒子サイズへの影響
$$粒子,サイズ(Y_{1}) = – 10.816 + 48.564X_{1} – 7.143X_{1} X_{3} + 11.855X_{2} X_{3} – 2.012X_{1}^{2} – 4.517X_{2}^{2} .$$
（4）
多分散指数への影響
総界面活性剤含有量（X2）が実際の因子の観点から多分散性指数に与える影響は、式（5）で表すことができます。
$$多分散性、指数left({Y_{2}}right)=0.175+0.125X_{2}.$$
（５）
ゼータ電位への影響
実際の要因の観点から、ゼータ電位に対するさまざまな要因とその組み合わせの影響は、式（6）で表されます。
$$ZP left( {Y_{3} } right) = – 47.416 + 1.67X_{2} + 2.611X_{3} – 1.381 X_{2} X_{3} .$$
（6）
捕捉効率への影響
BBDは、応答（Y4）を分析するには2次モデルが最も適していることを示唆している。表2に示すように、モデル項は有意である（p = 0.0163）、適合度の欠如は有意ではない（p = 0.3490）、モデルの適合性が証明されました。データから、温浴時間（X3）が有意な正の効果を示したことが明らかになりました（p = 0.0394）オン EE%値。図に示すように、総脂質含有量（X1）は p= 0.3552）および総界面活性剤含有量（X2 at p= 0.0840）は有意な効果を示さなかった。 EE%価値。さまざまな要因とその相互作用が価値に与える影響 EE%非線形回帰係数（Y4）は、実際の係数に関して、式（7）で表される。
$$EE left( {Y_{4} } right) = + 93.453 – 3.17X_{1} – 7.374X_{2} + 5.891X_{3} + 0.321X_{1} X_{2} + 1.157 X_{1} X_{3} + 1.308 X_{2} X_{3} – 0.048X_{1}^{2} + 0.499 X_{2}^{2} – 2.942X_{3}^{2} .$$
（７）
Design-Expert ソフトウェアは、全体的な望ましさが 0.773 の最適化された処方を作成しました。最適処方の独立変数は、次の値でした: 総脂質含有量 (X1): 2.128%、総界面活性剤含有量 (X2): 1%、温浴時間 (X3): 71 分。そこで、最適化された処方を合成し、4 つの応答を評価しました。
粒子サイズとゼータ電位分析
捕捉効率と薬物負荷量の決定
図1
RDV と RDV-NLC の XRD パターンの比較。
NLC では、固体脂質マトリックスが小さな油部分を囲んでいるため、結晶秩序が大きく乱れ、薬物の EE に大きく影響します31。したがって、液体脂質 MCT を固体脂質に組み込むと、結晶秩序が大きく乱れ、結晶格子に欠陥のある脂質マトリックスが生成されます52。結晶マトリックスのこれらの欠陥により、多くの薬物分子を収容するのに十分なスペースが提供され、結果として EE と DL 容量が高くなります31。
形態学的調査
図2
最適化されたRDV-NLCのFE-SEM画像（3つの倍率）（1つの） に （c): 10、100、200kx。
RDV-NLCの物理的安定性
表 3 DLS で測定した RDV-NLC 特性の変化 (4 または 25 °C で保存後の時間による)。各ポイントは 3 回の測定の平均値を表します。
独立した安定性試験も実施され、 EE30日後および90日後のRDV-NLCの％。3か月後のRDV-NLCの安定性の結果は満足のいくものでした（表4）。
表4 RDV-NLCの変化 EE4℃または25℃で保存後の時間に対する％。各ポイントは3回の測定値の平均値を表します。（EE％は式1を用いて計算した。
全体的に、データは、RDV-NLC がパラメータのわずかな変化を伴って両方の保管条件で安定していることを示しています。さらに、RDV-NLC の保管温度としては 4 ℃ よりも 25 ℃ の方が適していることが示唆されています33。
RDV放出の動態
RDV-NLC の投与量ダンピングのリスクを考慮するために、RDV 溶液と RDV-NLC の放出パターンを比較しました。シンク条件を維持するために、PBS/エタノール (1:1、v/v) を溶解媒体として使用し、RDV55 の溶解性を改善しました。
図 3 は、透析バッグに封入され、PBS/エタノール中で撹拌された RDV 溶液および RDV-NLC からの RDV 放出の速度論を示しています。ご覧のとおり、RDV は二相性の放出パターンを示しました。しかし、RDV-NLC からの RDV 放出速度は RDV 溶液からの放出速度よりも低く、NLC によって RDV 放出が制御されていることを示しています。
図3
透析バッグに封入し、PBS/エタノール、1:1、v/v、pH 7.4 で 37 ± 0.5 °C で 72 時間撹拌した RDV 溶液および RDV-NLC からの RDV の in vitro 放出速度。選択した時間間隔で 2 mL のアリコートを採取し、245 nm で UV-Vis により分析しました。各ポイントは 3 回の測定の平均値を表します。
ご覧のとおり、RDV 溶液の場合、最初の 10 時間で RDV の 90% が透析バッグから放出されます (図 3、青い曲線)。その後、透析バッグ両側の RDV 濃度の平衡により、RDV の放出はほぼ停止します。ただし、RDV-NLC の場合、RDV の放出速度は非常に遅いため、最初の 6 時間で RDV の約 30% しか放出されません。次のステップでは、約 10% の徐々かつ持続的な放出が 66 時間以上にわたって観察されます。
輸液との適合性
図4
さらに、 EE生理食塩水で希釈したRDV-NLCの％は48時間後に7％減少したが、これは脂質マトリックスの結晶度と多形相転移の継続的な変化に起因する可能性がある53。比較すると、 EE蒸留水中のRDV-NLCの割合は1.2%減少（80.3 ± 0.1%から79.1 ± 0.3%）しましたが、希釈前と有意な差はありませんでした。したがって、結果は、特に生理食塩水の存在下で希釈されたRDV-NLCは、室温で48時間保存した場合、一般的に使用される輸液と一般的に互換性があることを示しました。37、38、39。
インビトロ細胞毒性試験
ブランク NLC、RDV 溶液、および RDV-NLC の Vero 細胞株に対する細胞毒性効果を 24、48、および 72 時間調査しました (図 5a–c)。図 5 に示すように、ブランク NLC または RDV-NLC のいずれの形態でも、低濃度の NLC は細胞毒性を防ぐだけでなく、細胞の成長も促進します。これはおそらく、細胞の成長と増殖を促進することができる NLC 構造内の MCT の存在によるものです60。細胞表面の MCT の特異的受容体は GPCR84 (G タンパク質共役受容体ファミリーの 1 つ) であり、心臓、肺、肝臓、骨髄、腎臓、免疫細胞などのさまざまな細胞の表面に発現しています。MCT が受容体に結合すると、LYN タンパク質が細胞質内の下流シグナル伝達で活性化され、次に AKT 経路が活性化されます61。 AKT 経路では、細胞のアポトーシスに関与する BAD および FOXO タンパク質が不活性化され、代わりに、細胞の成長とタンパク質の翻訳に役割を果たす GSK および TSC タンパク質が活性化されます62。さらに、大豆レシチンは細胞内の脂肪酸生成の前駆体であり、ホスファチジルコリンはその誘導体の 1 つです。ホスファチジルコリン代謝は、主要な細胞膜成分を提供することで、細胞の生存と増殖シグナル伝達に重要な役割を果たします63。
図5
ブランクNLC、RDV溶液、およびRDV-NLCの連続希釈液を培養培地で24時間培養したVero細胞株の細胞生存率（1つの）、48（b）、72時間（c細胞生存率は式（3）を用いて計算した。各点は3回の測定の平均値を表す。
しかし、RDV-NLC は、特に低濃度から中濃度では、RDV 溶液よりも細胞毒性が低いことが示されました。したがって、NLC は RDV によって引き起こされる細胞毒性を軽減すると結論付けることができます。
最近の臨床試験では、COVID-19患者、特に高齢患者や腎疾患を患っている患者における急性腎障害とRDV治療との間に有意な関係があることが示されています67。また、RDV治療を受けたCOVID-19患者では、腎臓の糸球体濾過率が低下することが証明されています68。したがって、RDVの副作用を無視することはできません。しかし、MTTアッセイの結果は、RDVのマイナス効果とNLC成分の細胞生存率に対するプラス効果を確認しました。さらに、NLC成分は細胞膜の透過性を高めることができるため、RDV-NLCはRDVの取り込みを増加させ、COVID-19感染細胞に対する抗ウイルス活性を高める可能性があります。したがって、提案されたRDV-NLC製剤は、体細胞、特に腎細胞への副作用を軽減するためにRDVの代替として使用できる可能性があります。
RDV-NLCとこれまでに報告されたRDV製剤との比較
さらに、50 で報告されたものと比較して、NLC からの RDV の放出がより持続していることが観察されました。これは、NLC に組み込まれた脂質の構造によるものと考えられます。さらに、細胞毒性アッセイのセクションで述べたように、実験結果では、NLC (ブランク NLC または RDV-NLC のいずれの形態でも) が正常な健康細胞に対する細胞毒性が低いだけでなく、細胞増殖も増加することが示されました。この証拠は、上記のレポートでは考慮されていない、正常な Vero 細胞に対する RDV の副作用を軽減する NLC の役割を説明できます。
#ナノ構造脂質キャリアへの封入によるレムデシビルの細胞毒性および投薬過剰リスクの低減に関するin #vitro研究