全ゲノム配列決定とゲノム変異体
タイ全土の 5 つの地域から採取された 59 対の結核菌 DNA (表 1; テーブル S1）はイルミナおよびONTプラットフォームで配列決定され、バイオインフォマティクス分析を受けました（図を参照）。 S1 パイプラインの場合）。 ペアのサンプル全体で、Illumina の平均リード長は 149 bp、ONT は 2115 bp (四分位範囲 (IQR): 655 ～ 2594 bp) でした。 Illumina の平均読み取り数は 2,599,368 (範囲: 707,135 ～ 4,174,158)、ONT の平均読み取り数は 42,596 (範囲: 6572 ～ 121,132) でした。 H37rv 参照ゲノムに対する配列データのアライメントでは、プラットフォーム間の平均深さの違い (イルミナ 90.2 倍、ONT 17.4 倍) が明らかになりましたが、カバーされるゲノムの割合は両方のテクノロジーで少なくとも 5 倍高かった ( ONT 98.9%、イルミナ 98.7%)。 ONT および Illumina の複製全体にわたる遺伝子の平均カバレッジは、DR (rho = 0.25)、pe/ppe (rho = 0.57)、およびその他の遺伝子座 (rho = 0.29) 全体を含め、相関関係がありました (Spearman の rho = 0.30) (図 1)。 S2）。 rv1573 から rv1586 (系統 2 の欠失) および ppe50 (系統 1 の欠失) を含む遺伝子クラスター内を含む、系統特異的な大きな欠失のある領域では、平均カバー率が低かった (< 60 倍) (図 S2、 S3）。 高品質の SNP の平均数 (「」を参照)メソッド”) イルミナの場合は 1618 (範囲: 561 ～ 2012)、ONT の場合は 1567 (範囲: 548 ～ 2095) でした。 DNA複製とプラットフォーム間では、ペアの差異の数は少なく（中央値18、IQR 8～55）、SNP比は1に近かった（イルミナ対ONT比：中央値1.002、IQR 0.987～1.016）（表） S2）。
表 1 59 種類の結核菌分離株の特徴。
系統
TB-Profiler ソフトウェアを使用すると、ONT と Illumina のペアの間で系統および遺伝子型の耐性プロファイルが同一でした。 分離株の大部分は系統 1 (L1 n = 30、50.8%) および 2 (L2 n = 25、42.3%) からであり、系統 3 (L3 n = 1、1.7%) および 4 (L4 n =) のものは少数でした。 3、5.1%) (表 1; テーブル S1）、これはタイでの蔓延を広く表しています。5、6。 ONT データにより、系統特異的な大きな欠失 (差分領域 (RD)) の特定が可能になりました。 北京株 (L2) は RD105 を持っていましたが、RD239 と RD147c は L1 に特有であり、RD750 は L3 に、RD122 は L4 に特有でした。 RD11 欠失は系統 L1.1.1 に存在し、L1.2.1.2.1 には存在しませんでした (20/59)。これは以前の研究と一致しています。7。 RD210 は系統 L1.2.1.2.1 株で普遍的に検出されました (8/59)。 RD152 はすべての L2.2 株と L3 株に存在し、他の研究の結果を裏付ける8 （テーブル S3）。
薬剤耐性
30 の分離株 (50.1%) は、イソニアジド (15/59、25.4%)、リファンピシン (7/59、11.8%)、MDR-TB (5/59、8.4%)、および前結核薬を含む抗結核薬に対して耐性を示しました。 -XDR (1/59、1.7%) (表 1）。 リファンピシンとイソニアジドについて表現型の薬剤感受性データが生成され、遺伝子型の耐性プロファイルが確認されました。 DR 変異の頻度は、公的タイ (「その他のタイ」、n = 1456) および「Global50k」(n = 50,722) データセットの頻度と比較されました (表 2; テーブル S1）。 イソニアジド耐性の根底にある最も頻度の高い変異は、katG Ser315Thr (9/59; その他のタイ 56.9%; 全世界 78.6%) および fabG1 -15C>T (5/59; その他のタイ 6.1%; 全世界 25.0%) でした。 リファンピシンについては、rpoB 450 コドン変異 Ser450Trp および Ser450Leu が存在しました (5/59、その他のタイ 36.4%、世界 58.8%)。 あまり蔓延していないと考えられるいくつかの変異、すなわちエチオナミド (ethA Thr232Ala 5/59) およびピラジナミド (pncA Ser104Arg 5/59) が同定されました。 シプロフロキサシンまたはフルオロキノロン耐性の基礎となる変異は、gyrA Asp94Gly (1/59) および gyrB Asp494Ala (1/59) でした。 PAS に関連した thyX -16C>T 変異も検出されました (1/59)。 いくつかの潜在的なストレプトマイシン変異も見つかりました (rpsL Lys43Arg、rpsL Lys88Arg、rrs 514A>C、rrs 517C>T) (表 2）。
表 2 59 個の結核菌分離株で同定された薬剤耐性変異。
ONT データを使用して、既知の薬剤耐性遺伝子全体の構造変異をスキャンしました (表 3）。 10株の分離株で欠失が確認され、イルミナのデータによって確認された。 同定された欠失のサイズはプラットフォーム間で同様であり（範囲：ONT 35～10,981 bp、Illumina 27～10,983 bp）、Rv3083、Rv1258c、eis、thyA の欠失はほぼ遺伝子全体をカバーしていました。 1 つの分離株 (S27) には、eis 遺伝子が欠失していました。 eis の過剰発現は抗生物質カナマイシンに対する耐性の主な原因であり、その完全な欠失により抗生物質に対する結核菌の感受性が高まる可能性があり、これは典型的な DR 機構の逆転であることが判明しました。9。 さらに、特定の抗生物質の有効性に影響を与える可能性がある、fbiC 遺伝子の末端近くに欠失を持ついくつかの分離株を特定しました。10。 いくつかの研究では、遺伝子の末端近くで発生する突然変異と細菌のMICの増加およびデラマニドに対する耐性の高まりとの関連性が示されています。11。 これらの発見は、これらの fbiC 欠失の影響についてさらなる研究の必要性を強調しています。
表 3 Oxford Nanopore Technology プラットフォームを使用して見つかった欠失。
系統解析と伝達
すべてのサンプルにわたって検出された SNP を使用した系統解析により、系統ごとに予想されるクラスター化が明らかになり、複製分離株がツリー上でペアになっていることが明らかになり、ONT 分離株とイルミナ配列分離株の間の相違が最小限であることが示されました。 しかし、ONT配列決定された分離株は、わずかに長い枝の長さを示す傾向があります（図1）。 1）。 他のタイ分離株（n = 1456）との組み合わせ解析では、最大 20 SNP 差の SNP 類似性閾値で、サイズ範囲が 2 ～ 224、サイズ中央値が 2 の 153 個のクラスターが同定されました（図 1）。 2）。 7 つのクラスターには 15 の研究分離株が含まれ、5 つのクラスターにはそれぞれ 2 つの研究分離株のみが含まれます。 さらなるクラスター (n = 41) には 2 つの研究分離株が含まれており、少なくとも Roi Et 地域に由来する MDR-TB サンプルで形成されていました。 他のクラスター (n = 7) には、薬剤感受性のある研究分離株が 3 株ありました (すべてチェンライ由来)。 SNP 差が 5 および 10 の閾値では、それぞれ 134 (サイズ範囲: 2 ～ 150 サンプル) および 154 (サイズ範囲: 2 ～ 213 サンプル) のクラスターがありました。 これらのより厳しい SNP 閾値では、サイズ 2 以上のクラスター内に少なくとも 17 の研究分離株があり、これには MDR-TB が優勢なクレード内の 2 つの研究分離株が含まれます。
系統樹分析。 系統樹は、Oxford Nanopore Technologies (ONT) および Illumina プラットフォームを使用して配列決定された複製の高度な一致とクラスター化を明らかにします。
私たちの研究分離株（n = 59; 四角）と他のタイ分離株（n = 1456; 丸）のタイ分析を組み合わせた結果、類似性の高いクラスターが明らかになりました。 リンクされた分離株間の差異が 20 SNP 以下であるカットオフ値を適用しました。 正方形はこの調査に含まれるサンプルであり、画像は「tgv」ツールを使用して作成されました (https://github.com/jodyphelan/tgv）。
pe/ppe 遺伝子の構造変異体
Pe/ppe 遺伝子は、結核菌ゲノム内の非常に可変性の高い遺伝子領域 (約 10%) であり、ヒト宿主との相互作用に関与しています。12。 非常に変動しやすい性質があるため、通常は分析から除外されます。 しかし、ONT シーケンス データを使用すると、すべてのサンプルにわたって 56 pe/ppe 遺伝子の 830 個の欠失が特定されました (表 S4）。 分析により、いくつかの系統特異的な欠失が明らかになりました。 例えば、L1株ではppe50遺伝子が完全に欠失している（図1）。 3）、L3株におけるppe66/67欠失（表 S4)、L1.2.1.2.1 固有の pe_pgrs2 と pe_pgrs6 の小さな削除。 ppe8 遺伝子には複雑さがあり、L1 株では遺伝子の開始部分に欠失があり、L2 では含まれる RD304 領域が存在しました。 また、遺伝子融合事象も発生し、すべての L2 株でそれぞれの遺伝子境界に pe_pgrs3 および pe_pgrs4 遺伝子の欠失が見られました。 ppe34 および pe_pgrs10 を含むいくつかの pe/ppe 遺伝子には、研究分離株のほとんどにわたって小さな欠失があることが判明しました。 私たちの系統特異的な構造変異は、PacBio ロングリードデータを使用した以前の研究を裏付けました。12 （テーブル S4)、私たちのアプローチとデータの信頼性と再現性を強調します。
Oxford Nanopore Technologies (ONT) および Illumina (Illumina) プラットフォームで特定された、薬剤耐性および系列 (差異領域、RD) に関連する選択された検出された構造変異体を示す配列カバレッジ プロット。 カバレッジは、側面に分離ラベルが付いた青い丘で示されます。 (A) RD105 欠失が分離株 S15 (系統 2.2.1) で確認されました。 リネージュ 2 のすべてのサンプルにはこの欠失が含まれていました。 (B) RD152 欠失が分離株 S24 で確認されました。 これは欠失全体に及ぶわけではありませんが、系統 2 のすべてのサンプルにわたって一貫したパターンが観察されており、共通の欠失特性が示唆されています。 (C) 系統 1 のすべての株に存在した分離株 S66 の ppe50 遺伝子の欠失。 (D) 分離株 S27 における eis 遺伝子の完全な欠失。これは薬剤耐性に関連している可能性があります。
1709440401
#結核の臨床および監視アプリケーション向けのマルチプラットフォーム全ゲノム配列決定
2024-03-03 04:20:02