雑誌に掲載された最近の研究では 自然科学者たちはマウスモデルを使用して、 生きている 遺伝子サイレンシングは、コレステロール恒常性の維持に関与する遺伝子を標的とすることによって、遺伝子操作された転写抑制因子の一過性送達および発現後に維持される。
勉強： ヒットアンドランエピゲノム編集による耐久性と効率的な in vivo 遺伝子サイレンシング。 画像クレジット: ART-ur / Shutterstock
背景
遺伝性疾患の治療において非常に有望な方法は、一次デオキシリボ核酸 (DNA) 配列を変更せずに遺伝子を沈黙させることができるエピジェネティック編集です。 エピゲノム編集には、自然に発生し、プログラム可能な DNA 結合ドメインを標的とする転写抑制因子から得られるエフェクター ドメインを使用するデザイナー エディターが関与します。 このような DNA 結合ドメインには、ジンクフィンガータンパク質 (ZFP) および転写活性化因子様エフェクター (TALE) が含まれます。
クルッペル関連ボックスまたは KRAB ファミリーに由来する転写抑制因子は、遺伝子サイレンシングについて広く研究されており、両方の領域で強力な遺伝子抑制を誘導する能力を示しています。 生きている そして 試験管内で さまざまな細胞タイプの研究。 KRAB ベースのエディターによるこの遺伝子サイレンシングは、ヒストン修飾酵素を使用して実行されます。 しかし、体細胞におけるKRABベースのエディターの使用は不安定であり、これらのエディターを安定して発現させるためにウイルスベクターを使用すると、突然変異誘発の危険性が高まります。
したがって、この研究者チームは、KRABとともに、酵素de novo DNAメチルトランスフェラーゼA（DNMT3A）の触媒ドメインとその補因子DNMT3A様を含む、内因性遺伝子を特異的かつ永続的にサイレンシングできる遺伝子操作された転写抑制因子を開発した。
研究について
本研究では、研究者らは、操作された転写抑制因子の一過性発現が、 生きている 持続的な遺伝子サイレンシングを誘発する可能性があります。 このために、彼らはマウスモデルを使用し、 Pcsk9 この遺伝子は肝臓の肝細胞細胞膜上の低密度リポタンパク質受容体の分解を促進し、それによって循環コレステロールレベルを制御します。
操作された転写リプレッサーは、エピジェネティックサイレンシング中に遺伝子のプロモーターエンハンサー領域を標的とし、その領域の活性化ヒストンマークと抑制ヒストンマークを協調的に除去して沈着させます。 さらに、CpG アイランドとして知られる、シトシンとグアニンのヌクレオチドのペアが連続して発生する部位での DNA メチル化も、内因性メチルトランスフェラーゼの作用により増加します。 このプロセスは、エピジェネティックなサイレンシングの耐久性を決定します。
今回、研究者らはマウスから肝癌細胞株を作製し、肝癌細胞株の単細胞レベルの転写活性を報告した。 Pcsk9 遺伝子。 この細胞株は、 Pcsk9 プロモーター。 3 つのプログラム可能な DNA 結合ドメイン プラットフォームには、ZFP、TALE、および触媒的に不活性化されたクラスター化規則的に間隔をあけられた短いパリンドローム リピート (CRISPR) 関連タンパク質 9 (dCas9) が含まれていました。
エディターメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を担持する脂質ナノ粒子がマウスに投与された。 治療されたマウスからの血漿サンプルを分析して、PCSK9 タンパク質のレベルを決定しました。 さらに、ゲノム DNA サンプルは、 生きている 分子分析、および精製肝細胞を使用して、ターゲットディープシークエンシングまたは T7 エンドヌクレアーゼ検出アッセイによる編集およびエピゲノム編集の効率を定量化しました。
さらに、トリプル操作された転写リプレッサーの組み合わせは、進化した操作された転写リプレッサー、つまりプラットフォームの分子の複雑さを軽減するオールインワン分子に変換されました。
結果
その結果、ZFP が、エピジェネティックなサイレンシングを最も効率的に実行するプログラム可能な DNA 結合ドメイン プラットフォームとして選択されたことが報告されました。 Pcsk9 マウスの遺伝子。 さらに、脂質ナノ粒子内のエディター mRNA を 1 回投与すると、血漿中の PCSK9 タンパク質レベルを半分に減少させることに成功し、この効果はマウスモデルで 1 年近く維持されました。
これらのマウスでは肝部分切除術によって肝臓が強制的に再生されたにもかかわらず、 Pcsk9 遺伝子とエピジェネティックな抑制ヒストン マークは持続しており、操作された転写抑制因子によって導入されたエピジェネティックな状態が遺伝性であることを示しています。 さらに、EvoETRと呼ばれる進化した遺伝子操作された転写抑制因子は高い特異性プロファイルを有し、循環PCSK9タンパク質レベルの低下は従来の遺伝子編集法の結果に匹敵した。
リボ核酸干渉 (RNAi) と比較して、この遺伝子サイレンシング方法は、1 年間の効果を得るために 1 回の投与のみで済むため、より効率的で持続可能なことが判明しました。一方、RNAi では複数回の投与が必要でした。 EvoETR の使用には、他のゲノム編集方法とは異なり、DNA 切断を誘発せず、遺伝毒性を防ぐという追加の利点もありました。
結論
全体として、この発見は、プログラム可能な遺伝子操作された転写抑制因子の組み合わせ、特に簡素化されたオールインワン EvoETR の使用が、 Pcsk9 この遺伝子をマウスに導入し、循環血漿中の PCSK9 タンパク質レベルを 1 年近く減少させました。 この方法は、他の遺伝子編集方法が必要とする DNA 切断を誘発する遺伝毒性プロセスを回避します。 これらの結果は潜在的な可能性を浮き彫りにします 生きている エピジェネティックサイレンシングの治療への応用。
参考雑誌:
- カッペルッティ、MA、詩人、M.、ヴァルソーニ、S.、クアラト、P.、マーリン、S.、メレッリ、I.、& ロンバルド、A. (2024)。 ヒットアンドランエピゲノム編集による、耐久性があり効率的な in vivo 遺伝子サイレンシング。 自然。 DOI: 10.1038/s41586024070878、 https://www.nature.com/articles/s41586-024-07087-8
1709262221
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2024-03-01 02:26:00
