新しい方法は脂質膜を照らし、高解像度のタンパク質マッピングを可能にします

生物学では、見ることが理解につながる可能性があり、McGovern Institute for Brain ResearchのEdward Boyden教授の研究室の研究者は、命をより鋭い焦点にすることに取り組んでいます。一対の新しい方法で、彼らは2015年にグループが導入した高解像度のイメージング技術である拡張顕微鏡の能力を拡大しているので、研究者は光学顕微鏡下で細胞や組織を見るともっと見ることができます。

「私たちはすべてを見たいので、常にそれを改善しようとしています」と、MITの神経技術学のY. Eva Tan教授のBoyden氏は言います。 「基本的なビルディングブロックに至るまで、すべての人生のスナップショットが本当に目標です。」 Boydenは、Howard Hughes Medical Instituteの調査員であり、MITのYang Tan Collectiveのメンバーでもあります。

サンプルを染色し、画像を処理する新しい方法により、拡張顕微鏡のユーザーは、画像内の細胞の形状の鮮明な輪郭を見ることができ、単一組織サンプル内の多くの異なるタンパク質の位置を、従来の光顕微鏡のそれをはるかに超える分解能を示しています。これらの進歩は、どちらもジャーナルでオープンアクセス形式で報告されています 自然コミュニケーション、ニューロンの細い投影を追跡し、健康と病気に寄与する分子間の空間的関係を視覚化する新しい方法を有効にします。

膨張顕微鏡では、水吸収ヒドロゲルを使用して、生物学的組織を物理的に拡大します。ヒドロゲルによって組織のサンプルが浸透した後、水分補給されます。ヒドロゲルは水を吸収すると膨張し、組織内の分子の相対的な位置を保存し、互いにそっと引き離します。

その結果、拡張された組織が光学顕微鏡の下で見られると、混雑した細胞成分が別々に異なるように見えます。このアプローチは、標準的な実験装置を使用して実行できるため、ほとんどの研究チームが超解像度イメージングにアクセスできるようになりました。

拡張顕微鏡を最初に開発して以来、Boydenと彼のチームは、その方法を強化し続けています。解像度の増加、手順の簡素化、新機能の考案、他のツールとの統合です。

細胞膜の視覚化

チームの最新の進歩の1つは、2月12日の号（UMEXM）と呼ばれる方法と呼ばれる方法です。 自然コミュニケーション。

それにより、生物学者は膨張顕微鏡を使用して、細胞の境界を形成し、その内部のオルガネラを囲む薄い膜を視覚化できます。主に脂質と呼ばれる分子で構築されたこれらの膜は、光学顕微鏡でイメージングのために無傷の組織で密に標識することが困難であることで有名です。現在、研究者はUMEXMを使用して、組織内の細胞の超微細構造と組織を研究できます。

Tay Shin SM ’20、Ph.D。 Boyden’s Labの元大学院生であり、MITのTan-Yang自閉症研究センターのJ.ダグラスタンフェローである’23は、UMEXMの開発を主導しました。 「私たちの目標は最初は非常に単純でした。電子顕微鏡がテトロキシドオスミウムを使用して組織内の膜を視覚化する方法と同じように、無傷の組織で膜を標識しましょう」と彼は言います。 「これを達成するのは非常に難しいことがわかりました。」

チームは、最初に、光顕微鏡の下にある組織サンプルの膜を見えるようにするラベルを設計する必要がありました。 「私たちはほとんどゼロから始めなければなりませんでした」とシンは言います。 「私たちは、原形質膜にラベル付けされるプローブの基本的な特性について本当に考え、それからそれらを拡張顕微鏡に組み込む方法を考えなければなりませんでした。」つまり、膜を構成し、組織サンプルを拡張するために使用されるヒドロゲルと視界のために蛍光分子の両方にそれをリンクする脂質に関連する分子を工学することを意味しました。

膜の視覚化のための拡張顕微鏡プロトコルを最適化し、潜在的なプローブを広範囲にテストして改善した後、シンはラボで深夜に成功しました。彼は拡張組織サンプルを顕微鏡に置き、細胞の鋭い輪郭を見ました。

この方法により、拡張により高解像度が可能になったため、ボイデンのチームは、ニューロンから突き出ている小さな樹状突起を特定し、細長い軸索の長い拡張を明確に見ることができました。このような明快さは、研究者が脳の密に相互接続されたネットワーク内の個々のニューロンの経路をたどるのに役立つ可能性がある、と研究者は言います。

ボイデンは、これらの神経プロセスを「脳科学における私たちの時間の最優先事項」と呼んでいます。このようなトレースは、伝統的に電子顕微鏡に大きく依存しており、特殊なスキルと高価な機器が必要です。シンは、拡張顕微鏡検査は標準的な光顕微鏡を使用しているため、世界中の研究所がはるかにアクセスしやすいと言います。

ShinとBoydenは、拡張顕微鏡検査のユーザーが、特定のタンパク質がどこにあるかを示す脂質膜と蛍光ラベルを明らかにする新しい能力を組み合わせると、サンプルについてさらに学ぶことができると指摘しています。 「それは重要です。なぜなら、タンパク質は細胞の多くの仕事をしているからですが、細胞の構造に関してそれらがどこにあるかを知りたいからです」とBoyden氏は言います。

1つのサンプル、多くのタンパク質

そのために、研究者は、拡張顕微鏡を使用するときを確認するために、少数のタンパク質だけを選択する必要がなくなりました。マルチプレックス拡張拡張を明らかにする（MultiEXR）と呼ばれる新しい方法を使用すると、ユーザーは1つのサンプルで20以上の異なるタンパク質をラベル付けして見ることができます。生物学者はこの方法を使用して、タンパク質のセットを視覚化し、互いにどのように組織化されているかを確認し、それらがどのように相互作用するかについての新しい仮説を生成することができます。

2024年11月9日に報告された新しい方法の鍵 自然コミュニケーション、膨張した組織サンプルの蛍光標識抗体を特定のタンパク質に繰り返しリンクし、それらを画像化してから、これらを取り除き、新しい抗体セットを使用して新しいタンパク質セットを明らかにする能力です。 Postdoc Jinyoung Kangはこのプロセスの各ステップを微調整し、組織サンプルがそのままであり、標識されたタンパク質が画像の各ラウンドで明るいシグナルを生成したことを保証しました。

単一のサンプルの多くの画像をキャプチャした後、Boydenのチームは別の課題に直面しました。これらの画像が互いにオーバーレイされるように完全に整合していることを確認し、1つずつ標識および視覚化されたすべてのタンパク質の正確な位置を示す最終的な画像を作成します。

拡張顕微鏡では、生物学者が細胞の最も小さな特徴を視覚化することができますが、複数のラウンドのイメージング中に同じ特徴を何度も見つけるために、ボイデンのチームは最初により大きな構造に在籍する必要がありました。 「これらの視野は本当に小さく、あなたはそれを拡張すると、実際に非常に大きくなるこの非常に小さな視野を見つけようとしています」と、KangとともにMultiexRの開発を率いたBoyden’s Labの大学院生であるMargaret Schroeder氏は説明します。

毎回適切な場所に移動するために、チームは各組織サンプルを通過する血管にラベルを付け、これらをガイドとして使用することにしました。正確なアラインメントを有効にするために、すべての画像に一貫して表示される特定の細かい詳細も必要でした。このため、チームはいくつかの構造タンパク質をラベル付けしました。これらの参照ポイントとカスタマイズされたイメージング処理ソフトウェアにより、チームはサンプルのすべての画像を1つに統合することができ、個別に視覚化されたタンパク質が互いにどのように配置されたかを明らかにしました。

チームはMultiEXRを使用して、アルツハイマー病の影響を受けた脳で有名な異常なタンパク質クラスターであるアミロイドプラークを調べました。 「私たちはそれらのアミロイドのプラークの中を見て、それらの内側にあるものを尋ねることができましたか？そして、私たちは多くの異なるタンパク質を汚すことができるので、私たちはハイスループット探査を行うことができます」とボイデンは言います。チームは、23種類のタンパク質を選択して画像を表示しました。このアプローチは、特定の神経伝達物質受容体（AMPARS）の存在など、いくつかの驚きを明らかにしました。

「これは、神経科学のすべてで最も有名な受容体の1つです。神経科学における病理学の最も有名な分子特徴の1つに隠れています」とボイデンは言います。アルツハイマー病での受容体がどのような役割を果たしているのかは不明ですが、その発見は、細胞内をより多く見る能力が生物学の予期しない側面を暴露し、研究のための新しい質問を提起する方法を示しています。

このストーリーは、MITの研究、革新、教育に関するニュースをカバーする人気のあるサイトであるMIT News（web.mit.edu/newsoffice/）の好意により再発行されています。