目標の決定
カプリポックスウイルス標的タンパク質の発現と精製
RVFV核タンパク質の発現と精製
RVFV ヌクレオカプシド (NP) タンパク質の発現のためのプラスミド pET 32a-RVFV NP を使用して、BL21a 細胞 (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) を形質転換しました。形質転換は、T7 プロモーターおよび T7 ターミネーター プライマーを使用した DNA 増幅によって確認されました。使用したサーモサイクラー条件は次のとおりです: (1X) 95 °C、10 分。 (30X) 95 °C、30 秒。 55℃、30秒。 72℃、1分30秒。 (1X) 72 °C、2 分。 4℃に保ちます。細胞はカルベニシリン (Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) を含む Luria-Bertani (LB) ブロス培地 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で増殖させ、タンパク質発現は 0.3% L-アラビノースと 1 mM IPTG ( Merck KGaA（ドイツ、ダルムシュタット））を 5 時間。最初の発現試験は、時点 T0h、T1h、T2h、T3h、T4h、および T5h で実行されました。細胞を機械的に溶解し、組換えNPをInvitrogen Probondキット（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）によって精製しました。このキットは、ニッケルカラムを使用してHisタグ付きタンパク質に結合するアフィニティー精製に基づいています。タンパク質のネイティブな立体構造が必要だったので、ネイティブな精製条件 (結合には 10 mM イミダゾール、洗浄には 20 mM、溶出には 250 mM イミダゾール) の下でメーカーが記載する市販のプロトコールに従いました。緩衝液交換では、MWCO 3 kDa の Amicon 濃縮装置 (Merck KGaA、ドイツ、ダルムシュタット) を使用して、元の緩衝液を保存緩衝液 (50 mM トリス HCl、150 mM NaCl、25 mM スクロース、およびプロテアーゼ阻害剤丸薬、 pH8.0）。
RVFV 核タンパク質の定量化
タンパク質定量化には Pierce BCA を製造元の指示に従って使用しました (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)。
ウェスタンブロット
タンパク質をSDS-PAGEで分析した。ヤギおよびウシの両方の陽性血清における抗体結合は、ウエスタンブロットによって確認された。
SDS-PAGE ゲルおよびウェスタンブロット用のタンパク質の調製は標準手順に従いました。タンパク質調製物（20μL）を4X LDSサンプルバッファー（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA）中で80℃で10分間加熱しました。サンプルを SDS-PAGE (NUPAGE 10% (v/v)) ゲル (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) に転写し、0.2 μm PVDF メンブレン (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) に転写しました。メンブレンを抗ペンタ His 抗体 (1:1000) (Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) を用いて室温で 1 時間プローブし、0.5% (ドイツ、ダルムシュタット) を含む PBS で 3 回洗浄しました。v/v）Tween 20（PBS-T）を使用し、西洋わさびペルオキシダーゼに結合した希釈（1:5000）ヤギ抗マウス抗体（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）で1時間プローブしました。検出には、ECL 基質 (GE Healthcare、米国イリノイ州シカゴ) を製造業者の指示に従って使用しました。
RVFV NP ELISA
炭酸/重炭酸緩衝液、pH 9.6 vf = 50 μL中のRVFV NP精製抗原1ウェルあたり100 ngを、96ウェルプレート(Polysorb、Nalgene)中で4℃で一晩振盪した。プレートを１×ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、５０μＬのタンパク質を含まないブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）（以下、ＢＢ１として知られる）で３７℃で３０分間ブロックした。希釈した血清を添加し、37℃で90分間インキュベートした。プレートを１×ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１：１０ｋに希釈したＨＲＰ結合二次抗体（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）を添加し、室温で４５分間インキュベートした。プレートを1×PBS-Tで3回洗浄し、ウェル当たり100μLのTMBを添加し、暗所で10分間インキュベートした。ウェルごとに100μLの停止液を加え、プレートを450nmで読み取った。
ウイルス中和試験
山羊痘血清サンプル
実験血清とフィールド血清
この研究では 4 種類の参照集団血清を使用しました: (a) ブルガリア (NDRVMI、ブルガリア、ソフィア) および北マケドニア共和国 (学校) の自然に LSDV 感染した動物から得られたウシ LSD 陽性血清 (n = 77)北マケドニア共和国、スコピエの「Ss Cyril and Methodius」大学獣医学）。これらのサンプルは VNT によって LSD 陽性であることが確認されました。 (b) 歴史的にこの病気が存在していない国、すなわちフランス（フランス、モンペリエのIDVetによって提供）、オーストリア（オーストリア、AGESによって提供）、および北マケドニア共和国からのウシLSD陰性血清（n = 59）。 （2010年以前に採取された血清）（北マケドニア共和国、スコピエの「Ss Cyril and Methodius」大学獣医学部）。 (c) ピルブライト (英国)、LCV (マリ) からの実験的に感染した動物から採取した山羊痘陽性のヒツジおよびヤギ血清 (n = 27) [29] および AHI (エチオピア) [30]VNTによって陽性が確認されたもの。 (d) 歴史的にこの病気が存在しないオーストリア産の山羊痘陰性ヒツジおよびヤギ血清 (n = 181) (オーストリアの AGES 提供)。補足表 1 を参照してください。
特異性制御血清
パラポックスウイルス陽性血清を使用して交差反応性を測定しました。それらは、12 個の orf 自然感染ヤギサンプル (フランス、トゥールーズ、エコール獣医院トゥールーズ校のステファン・ベルタニョーリ氏提供)、ザンビアの偽牛痘 (PCP) 陽性牛血清 4 個 (ザンビア、CVRI のモーリーン・ジバ氏提供)、およびウシ 1 匹で構成されていました。丘疹性口内炎（BPS）（提供者： AGES、オーストリア）。補足表 1 を参照してください。
縦断的研究からの血清
縦断的研究からの 3 セットのサンプルを使用しました。最初のセットは、毒性の強い南アフリカ産 LSDV ニースリング株に実験的に感染させた 2 頭の牛から、感染後 0、6、12、18、20、23、26、および 30 日 (DPI) に収集されたサンプルで構成されていました。 [31]。 2 番目のセットは、GTPV オマーン 84 に実験的に感染した 4 頭のヤギから 0、7、14、21、28、35、42、49、および 56 DPI で収集されたサンプルで構成されました。これは、実験的に感染したエチオピアのヤギを用いた大規模な GTPV 研究の一部でした。 [30]。 3 番目のセットは、LCV (マリ) によって生産された 1 頭の羊からのサンプルで構成されていました。 [29]。羊を実験的に SPPV Algeria/93 Djelfa に感染させ、サンプルを 0、7、14、21、および 28 DPI で収集しました。
RVF 血清サンプル
世羅
この研究では、4 種類の RVF 血清の参照集団を使用しました: (a) ザンビアから入手したウシ RVF 陽性血清 (n = 6) (ザンビア CVRI の Maureen Ziba 提供)、コートジボワールの野外感染牛(ビンガービルの中央動物病理研究所、エマニュエル・クアシー・ハイマン博士提供)、および市販のウシ RVF 陽性血清サンプル (IDVet、モンペリエ、フランス)。これらのサンプルは、cELISA (IDvet、モンペリエ、フランス) によって陽性であることが確認されました。 (b) この病気が歴史的に存在していない国、すなわちフランス (フランス、モンペリエの IDVet によって提供)、オーストリア (オーストリアの AGES によって提供)、および英国 (パーブライト研究所によって提供) からのウシ陰性血清 (n = 56) ); (c) イタリア、テラモでのヤギ実験感染からの RVF 陽性ヒツジおよびヤギ血清 (n = 13) (Diagnostica e Sorvegrianza Malattie Esotiche、Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise “G.Caporale” の Chiara Pinoni 提供) ）、および研究所での定期検査中に収集された羊およびヤギの野原感染症コンゴ民主共和国キンシャサ獣医。これらのサンプルは、cELISA (IDvet、モンペリエ、フランス) によって陽性であることが確認されました。 (d) 歴史的にこの病気が存在しないオーストリア産の陰性ヒツジおよびヤギ血清 (n = 180) (オーストリアの AGES より提供)。すべてのサンプルは cELISA (IDvet、モンペリエ、フランス) によって陰性であることが確認されました。補足表 1 を参照してください。
Luminex マルチプレックス血清学的アッセイ
標的抗原のビーズへの結合
ウイルス標的抗原は、Anderson et al.に基づく修正プロトコールに従って、領域 34 および 63 のポリスチレン カルボキシル磁気ビーズ (Bio-Rad、Hercules、California、USA) に共有結合しました。 [32]。簡単に説明すると、1.5 mlエッペンドルフチューブに入れた1.2×106個のビーズを洗浄し、100μLの滅菌水で1回、100μLの活性化緩衝液(0.1Mリン酸ナトリウム(一塩基性)、pH6.2)で3回洗浄し、ボルテックスし、超音波処理した。分離は磁気分離スタンド (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を介して実行されました。ボルテックスと超音波処理の最終ラウンドの後、ビーズを 80 μL の活性化バッファーに再懸濁しました。活性化緩衝液で希釈した、新たに作製した50 mg/mL Sulfo-NHS (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、米国) 10 μLおよび50 mg/mL EDC (Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ) 10 μLをミクロスフェアに添加しました。プレートシェーカー上で暗所で２０分間インキュベートした後、ビーズを磁気的に分離し、５００μＬのカップリング緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ ｐＨ７．４）に再懸濁し、続いてボルテックスし、超音波処理した。カップリング緩衝液で２回洗浄し、ボルテックスし、超音波処理した後、ビーズを１００μＬのカップリング緩衝液に再懸濁した。 300μLのカップリング緩衝液中の10μgの精製RVFV NPまたはA34-CaPV抗原を、対応する再懸濁カルボキシル磁気ビーズ(RVFVの場合は領域63、またはA34-CaPVの場合は34)に添加した。ビーズの種類ごとに、カップリングバッファー中の最終容量は 400ul でした。ビーズを、暗所、室温、200 rpmのプレートシェーカー上で10分間隔でボルテックスしながら2時間インキュベートしました。次いで、それらを磁気的に分離し、１０００μＬの洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ ７．４）で２回洗浄し、続いてボルテックスし、超音波処理した。ビーズの磁気分離後、ミクロスフェアを２５０μＬのＢＢ１中に一度再懸濁し、次いで上記のようにボルテックスし、超音波処理した。次に、ビーズを磁気分離器で分離し、100 μL の BB1 に再懸濁し、暗所で 4 °C で保存しました。カップリング反応後に回収されたマイクロスフェアの数を血球計で計測した。
Luminex マルチプレックス アッセイ
濾過したマイクロプレート（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を、各ウェルを50μLの洗浄緩衝液（10X PBS、0.05% Tween 20）で2回、そして50μLのBB1で1回満たすことによって、予め湿らせた。液体を、真空マニホールド（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を介してプレートの底部にあるフィルターを通して除去した。最終容量 5 μL の BB1 ごとにサンプルまたはコントロールごとに 1000 結合ビーズを、ウシサンプルの場合は BB1 で 1:500、ヒツジの場合は BB1 で 1:2000 に希釈した血清 100 μL に添加しました。またはヤギのサンプル。プレートを蓋で覆い、アルミホイルで包み、300 rpmに設定した水平軌道マイクロプレートシェーカー上で4℃で一晩インキュベートしました。次いで、液体を真空マニホールドで除去した。 150μLの洗浄緩衝液を各ウェルに加え、液体を真空マニホールドで除去した。これを４回繰り返した。希釈した種特異的（抗反芻動物）ビオチン結合二次抗体（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）（以下、SGB）50 μl を、ウシサンプルの場合は BB1 で 1:10 k、ウシサンプルの場合は BB1 で 1:40 k に希釈します。ヒツジまたはヤギのサンプルを各ウェルに加えました。プレートを、３００ｒｐｍに設定した水平軌道マイクロプレートシェーカー上、室温、暗所で３０分間インキュベートした。次いで、液体を真空マニホールドで除去し、150μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した。 BB1 で 1:250 に希釈した希釈ストレプトアビジン – PE 50 μl を各ウェルに添加しました。プレートを、３００ｒｐｍに設定した水平軌道マイクロプレートシェーカー上、室温、暗所で１０分間インキュベートした。液体を真空マニホールドで除去し、ウェルを150μLの読み取り緩衝液(0.01M PBS pH 7.4)で5回洗浄した。 50μlの読み取りバッファーをウェルに添加した。プレートを３００ｒｐｍで１分間振盪した。さらに、75μLの読み取りバッファーを各ウェルに添加した(最終容量125μL)。プレートをBioPlex 200 Luminex装置（Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で読み取った（50ビーズ/領域、および50μL/サンプルの容量を使用してビーズセットごとの各反応イベントについて中央値を取得）。
特に明記しない限り、すべてのサンプルを二重に分析し、平均読み取り値を計算しました。すべてのサンプルについて、マルチプレックス アッセイの平均蛍光強度 (MFI) データは、血清添加シグナルから血清無添加のコントロール シグナルを差し引くことによってバックグラウンド レベルについて補正されました。
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#国内の反芻動物における抗カプリポックスウイルスおよびリフトバレー熱ウイルス抗体を検出するためのルミネックスベースのアッセイの開発 #ウイルス学ジャーナル
2024-12-27 03:26:00