調査対象母集団
本研究は、オリーブオイルによるCORonary Diet Intervention and cardiovascular PREVention Study（Clinicaltrials.gov番号NCT00924937）の略称であるCORDIOPREV研究の一環として実施された。 この研究はスペインのコルドバにあるソフィア王妃芸術センターで実施されました。 研究デザインには、単一センター、無作為化、単一盲検、管理された食事介入が含まれていました。 合計 1,002 人の CHD 患者が対象となり、理論的根拠、研究方法、包含基準と除外基準、心血管危険因子、および患者のベースライン特性に関する詳細な情報が最近発表されました。 [13]。 簡単に言うと、適格な患者には、CHDを確立しており、過去6か月以内に臨床的な冠動脈イベントがなく、長期の食事介入を続けることができ、重篤な症状がない20歳から75歳の男性と女性が含まれていました。病気や予想余命が研究期間よりも短い場合。 年齢の上限は、試験の構想時（2007年）の平均余命に基づいて設定されており、現代の長期心血管研究における通常の慣行と一致していた。
研究に参加する前に、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。 この研究プロトコールは、施設および適正臨床基準のガイドラインに従って、ソフィア王妃芸術センターのヒト調査検討委員会から承認を受けました。
CORDIOPREV 研究の主な目的は、長期追跡研究を通じて、CHD 既往患者の臨床事象と死亡を予防する地中海食の有効性を低脂肪食と比較して評価することです。 ここでは、CORDIOPREV 研究の二次アウトカムの 1 つである T2DM 発生率の結果を報告します。 この研究では、研究開始時にT2DMと診断されていなかった1002人の患者のうち462人を対象にしました。 ベースライン時の非T2DM患者のうち、アメリカ糖尿病協会（ADA）の診断基準によれば、107人の患者がT2DM（インシデント-T2DM）を発症しました。 [14]中央値60か月の追跡調査後。 この研究では、TL データがなかったため 19 人の患者が除外されました。 したがって、最終サンプルは 338 個の非 T2DM と 105 個のインシデント T2DM で構成されました (追加の図)。 1）。 毎年、T2DM の発生率は ADA の T2DM 基準に従って評価されました：空腹時血漿グルコース ≥ 126 mg/dL または 75 g 経口ブドウ糖負荷試験での 2 時間血漿グルコース ≥ 200 mg/dL またはグリコシル化ヘモグロビン (HbA1c) レベル ≥ 6.5% 。 明確な高血糖がない場合、診断には同じサンプルまたは 2 つの別々のテストサンプルからの 2 つの異常な検査結果が必要です。 [14]。
このサブ研究のサンプルサイズと検出力の計算は、次の仮定に基づいて計算されました: 地中海食グループの T2DM 発生率は 10%、低脂肪グループでは 17%、統計検出力は 80% 、2 つの尾の α = 0.05 です。 これらの仮定に基づいて、推定損失の 10% を仮定して、各食事介入グループの 163 人の患者から必要なサンプル サイズが確立されました。 今回の研究では、ベースライン時に臨床的にT2DMと診断されていなかったすべての被験者が含まれた(n = 462; 216人が低脂肪食、246人が地中海食)。 このグループのうち、T2DM を発症した被験者 107 名全員が含まれていました (低脂肪食 42 名、地中海食 65 名)。 残りの355人の被験者はT2DMと診断されなかった（174人が低脂肪食、181人が地中海食）（追加図）。 1）。
ランダム化とマスキング
ランダム化はアンダルシア公衆衛生大学院によって行われました (1:1 の比率)。 栄養士は、各参加者の食事グループについて知っている介入チームの唯一のメンバーでした。 簡単に言うと、ランダム化は次の変数に基づいて行われました: 性別 (男性、女性)、年齢 (60 歳未満および 60 歳以上)、心筋梗塞の既往 (はい、いいえ)。 ランダム化に関する詳細は以前に報告され、まとめられています。 [15]。
食事介入
患者は、2 つの異なる健康的な食事モデルのうちの 1 つを受けるように無作為に割り付けられました。(1) カロリーの最低 35% が脂肪 (22% 一価不飽和脂肪酸、6% 多価不飽和脂肪酸、10% 未満の飽和脂肪酸)、15% がタンパク質、そして最大 50% の炭水化物、および (2) 国家コレステロール教育プログラムによって推奨されている、総脂肪の 30% 未満（一価不飽和脂肪酸 12 ～ 14%、多価不飽和脂肪酸 6 ～ 8%、飽和脂肪酸 10% 未満）の低脂肪食）、15％のタンパク質と最低55％の炭水化物。 どちらの食事でも、コレステロール含有量は 300 mg/日未満に調整されました。 本研究は 5 年間の追跡期間にわたって実施されました。 ダイエットに関する詳細は以前に報告され、まとめられています [15]。
患者はベースライン時と毎年、栄養士との個別の対面面接を受け、スペインで以前に検証された137項目の半定量的食事頻度アンケートに回答した。 [16]。 毎年、14 項目の地中海ダイエット遵守スクリーニング [17] 地中海食の遵守を測定するために使用され、低脂肪食の遵守を評価するために 9 項目の食事スクリーニングが使用されました。 さらに、両方の介入グループは同一の集中的な食事カウンセリングを受けました。 栄養士は、ベースライン時と半年ごとに個別の 1 対 1 の面接を実施しました。 さらに、四半期に一度の教育集合セッションは、各セッション最大 20 名の参加者で開催され、グループごとに個別のセッションが行われました。
実験室での測定
研究の開始時と追跡期間中は年に1回、12時間の一晩絶食した後、参加者から静脈血サンプルをEDTAチューブ（最終濃度0.1% EDTA）に採取し、血漿を赤血球から分離した。 1500 × g、4 °C で 15 分間遠心分離して細胞を分離し、すぐに -80 °C で凍結しました。 生化学的測定は、ソフィア王妃芸術センターで介入を知らされていない個人によって行われた。 脂質変数は、DDPPII Hitachi モジュラー分析装置 (Roche、スイス、バーゼル) を使用し、特定の試薬 (Boehringer-Mannheim、ドイツ、マンハイム) を使用して評価しました。 血漿トリグリセリドおよびコレステロール濃度は、酵素手順によって分析されました。 高密度リポタンパク質コレステロール (HDL-c) は、デキストラン硫酸 Mg2+ による血漿アリコートの沈殿後に測定されました。 低密度リポタンパク質コレステロール (LDL-c) 濃度は、次の式を使用したフリーデワルド方程式によって計算されました: LDL-c = 総コレステロール – (HDL-c + トリグリセリド / 5)。 グルコース測定はヘキソキナーゼ法により実施した。 高感度 C 反応性タンパク質 (hs-CRP) は、ELISA 技術 (BioCheck, Inc.、米国カリフォルニア州フォスターシティ) によって測定されました。
血液サンプルからの DNA の分離
DNAは塩析法によりバフィーコート画分から単離されました [18]10 mL のモントリオール-ボルチモア緩衝液 (0.32 M スクロース、0.1 mM トリス-HCl、pH 7.5、0.025 mM MgCl2、1% Triton X-100) を使用し、混合および遠心分離して核画分を分離します。 核ペレットを３ｍＬの核溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ）および１０％ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫでホモジナイズした。ＤＮＡを６Ｍ ＮａＣｌで沈殿させ、１００％洗浄した。 %エタノール。 最後に、ゲノム DNA を抽出し、500 μL の 1× TE バッファーに再懸濁しました。 DNA の純度および濃度は、NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher、Waltham、MA) を使用した分光測光法によって評価されました。
TLの定量的PCR分析
TL は、qPCR による Cawthon 法を使用して決定されました。 [19]。 すべてのサンプルについて、単一コピー遺伝子であるホモ・サピエンスのリボソームタンパク質 L13a 遺伝子 RPL13a (S) に対して正規化されたテロメア反復コピー数 (T) の相対比を推定しました。 各 PCR の結果は、参照 DNA サンプルを使用して構築された標準曲線と相対化されました。 テロメアおよび RPL13a 遺伝子 PCR の標準曲線は、8 つの DNA 参照標準 (1 ～ 25 ng) で構成されていました。 すべての PCR は、iQ5-BIORAD サーマルサイクラーおよび SensiFAST SYBR Lo-ROX キット (Bioline) を使用して実行されました。 変動係数 (%CV) は、テロメア反復コピー数については 9.32%、単一コピー遺伝子コピー数については 6.76% でした。 両方のアンプリコンのサーマル サイクラー プロファイルは、ポリメラーゼを活性化するために 95 °C で 3 分間のインキュベーションから始まり、続いて 95 °C で 5 秒、54 °C で 15 秒の 40 サイクルを行いました。 反応混合物の組成は、オリゴヌクレオチドプライマーを除いて同一であった：20 ng テンプレート DNA、1× SensiFAST SYBR Lo-ROX、200 nM リバースプライマー、および 200 nM フォワードプライマー。 各 PCR 反応の最終容量は 20 μL でした。 プライマー配列は (5’→ 3′) でした。
TeloFw、CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTT GGGTTTGGGTTTGGGTT; TeloRw、GGCTTGCCTTACCC TTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT; RPL13aFw、CCTGGAGGAGAAGAGGAAAAGAGA; RPL13aRw、TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA。
DNA 抽出と TL 測定は、ベースラインと 4 年の時点で実行されました。 追加の時点で TL を評価すると、さらに貴重な洞察が得られる可能性がありますが、本研究では 4 年の時点で TL に統計的に有意な変化は観察されませんでした。 この研究では、ショート TL (TL < パーセンタイル 20) のリスクがある個人を特定するためのマーカーとして、ベースラインでの TL の役割を評価します。
統計分析
統計分析は、STATA 14 (STATA Corp.、テキサス州、米国) を使用して実行されました。 連続変数には平均と平均の標準誤差 (平均 ± SEM)、カテゴリ変数にはパーセンテージを使用しました。 すべての p 値は両側検定であり、p < 0.05 は統計的に有意であると見なされました。
平均TLではなく最短TLの定義は、テロメア機能不全および細胞生存制限と関連している [20, 21]。 このようにして、患者は、以前に報告されているように、ベースラインでのショートTLのリスクに従って分類され、20パーセンタイル未満のTL、20パーセンタイルを超えるTLとしてリスクなしと定義されました。 [22,23,24]。
グループ間の比較には、スチューデントのアンペアを使用しました。 カテゴリ変数はカイ二乗検定を使用して比較されました。 フィッシャーの直接確率検定を使用して、参加者の T2DM 発生率と短期 TL のリスクとの関係を評価しました。 モザイクプロットは、T2DMの発生率と短TLのリスクとの関係を示すために適用されており、バーの高さは短いテロメアのリスクが高いまたは低い参加者の割合を表し、各バーの幅はT2DMの発生率に比例します。 ロジスティック回帰モデルを実行して、短いテロメアのリスクに応じて T2DM 発症のリスクを評価しました。 我々は、Cox 比例ハザード回帰を使用して、TL の潜在的な予測値と、糖尿病の発症リスクを軽減する食事モデルを選択するための TL の潜在的な役割をテストしました。 さらに、Cox 回帰モデルで食事グループごとの相互作用と短期 TL のリスクを評価する統計分析を実施しました。 回帰分析は、年齢、性別、体格指数（BMI）、腹囲（WC）、HbA1c、HDL-c、トリグリセリド、糖尿病と初期の冠状動脈性心疾患の両方の家族歴によって調整されました。 追加の分析として、TL がインシデント T2DM 患者と非 T2DM 患者の集団を分類する可能性を評価するために、受信者動作特性曲線 (ROC) 分析が実行されました。 我々は 2 つのモデルを実行しました。1 つ目は臨床変数 (BMI、年齢、性別、トリグリセリドおよびスタチンの使用) に基づいており、2 つ目は TL を追加したモデルです。
1710614455
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2024-03-16 18:31:46
