この研究の目的は、インフルエンザBウイルスHAタンパク質に対するアプタマーを特定して発達させることでした。標的タンパク質を磁気ビーズに固定し、ランダムライブラリと組み合わせてPCR増幅を続けました。一本鎖核酸を、変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離して、二次ライブラリを作成しました。インフルエンザAウイルスのHAタンパク質、H1N1のHAタンパク質との陽性選択により、選択されたDNAアプタマーが特異的であることが保証されました。
DNAライブラリとプライマー
ランダムな36ヌクレオチド配列を含む76頭で構成されるSSDNAのライブラリは、サンゴンバイオテクノロジー（上海、中国）から供給されました。プライマーは、GenScript Biotech（Nanjing、China）から入手しました。シーケンスを表1に示します。
表1初期のSELEX DNAライブラリとプライマー
（i）36Nは36回のランダムオリゴヌクレオチドを示します。 （ii）プライマー指定内で、S1は前方プライマーを意味し、A2はリバースプライマーを意味し、S1-FAMは蛍光標識された前方プライマーを意味します。 （iii）A2-polyaは、ポリア尾が付いたリバースプライマーを指し、Polyaは19のアデノシン残基で構成されるPolya尾を示します。プライマーシーケンス内で、「Spacer 18」は18原子ヘキサチレングリコールスペーサーを表します。
アプタマーのin vitro選択
タンパク質スクリーニングキット（CAT NO。：SEP-201904）は、Anhui Aptamy Biotechnology Co.（Anhui、China）から購入し、以下の実験を実施しました。
図書館の解散
最初に、Libp1ライブラリーの1つの光密度（OD）の濃度を10 µMに希釈し、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）緩衝液（NaCl 137 mm、KCL 2.7 mm、Na2HPO4 8 mm、KH2PO4 1.5）、CACL2 1 MM、MM、MGCl2 0.5 MM、PHMM、PHMM、PHMM、MGCl2 0.5のSubtion -20°Cで。
正および負の選択タンパク質に関連するカルボキシル化磁気ビーズ
ライブラリの肯定的/否定的な選択
当初、ライブラリの変性が実行され、10μmの濃度に希釈されたライブラリから始めました。次に、混合物を12,000 rpmで10分間高速遠心分離を行いました。その後、再懸濁のために140μLのDPBSが追加されました。 100マイクロリットルを各PCRチューブに分散し、変性のためにPCRマシンに挿入しました。次の手順が適用されました。（1）温度は95°Cで10分間維持され、（2）氷水浴に5分間浸透して室温に達する。これにはプール0とラベル付けされました。ライブラリの正の選択には、50μLのMB-BSAをプール0に追加することが含まれていました。次に、混合物をシェーカーで室温で60分間インキュベートしました。その後、磁気ビーズを磁石を使用して配置し、上清をピペットで吸引し、プールとしてラベル付けしました。磁気ビーズは、200μLのDPBSで4回すすいだ。磁気ビーズを磁石を使用して配向し、200μLのDPBSをビーズに加え、水浴で10分間加熱しました。その後、ビーズは磁気的に分離され、上清を収集し、R溶出として指定しました。ライブラリの肯定的な選択のために、50μLのMB-HAがポジティブ選択に続いてプールに追加されました。肯定的な選択手順は、否定的な選択に使用されるものと同一でした。最終上清は、R-elution +蛍光定量PCRアッセイとして記録されました。 Roche 8-Liner PCRチューブアレイが使用されました。 QPCRミックス（28μL）を各ウェルに分注し、混合物を4〜20°Cの範囲の低温融解相にさらしたことを保証しました。その後、逆方向とポジティブ選択の両方のすすぎから獲得した上清が導入され、指定されたチューブからのR-溶出、R-溶出+、および2μLのアリコートが含まれています。空白のQPCRミックスで満たされた1つのチューブが予約され、2μLのスクリーニングバッファーがネガティブコントロールとして添加されました。蛍光定量的PCRプロトコルは次のとおりでした。95°Cでの初期変性は2分間。続いて、95°Cで1分間30サイクルの変性、60°Cで1分間アニーリングし、72°Cで1分間延長します。 72°Cで5分間の最終延長。
一本鎖DNA産生
PCR産物はN-ブタノールに濃縮されました。濃縮されたPCR産物を等量の2×Tbe尿素荷重緩衝液と混合し、沸騰水浴で10分間熱分解してDNA鎖を分離し、短いスピンの後に電気泳動ゲルに直ちに積み込みました。すべてのサンプルは、ブロモフェノールの青色染料の前部がゲルの底に到達するまで、300 Vの尿素変性ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にさらされました。この手順により、fam-labeled ssdnaは、ポリア尾で拡張された相補的なssDNAとハイブリダイズすることができました。尿素分離ポリアクリルアミドゲル溶液は、5 mLのページゲル混合、40μLの10％ペルサル硫酸アンモニウム（APS）、および9μLの9μLで構成されていました。 n、n、n‘、n‘ – テトラメチレチレンジアミン（TEMED）。ゲルは、fam-labled鎖を回収するために切除されました。当初、ゲルを抽出し、プラスチックフィルムに置きました。滅菌ブレードを使用して、目的のバンドを直接切除し、粉砕されたゲルを含む0.5 mLのエッペンドルフチューブに移しました。その後、チューブを1.5 mLのエッペンドルフチューブに挿入しました。この手順は、0.5 mLの断片化されたゲルを1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、12,000 rpmで2分間回転させ、1 mlのDPBSを1.5 mlのマイクロフージチューブに加え、10分間加熱し、12,000 rpmで再び回転し、1分間の加熱を吸収します。上清を15 mL遠心管に移し、特定の量のN-ブタノールと混合した。徹底的な混合の後、混合物を7500×で遠心分離しましたg 5分間。結果として得られる溶液は層別化を示し、それにより、上層と下層をそれぞれ慎重に吸引して回復させることができました。下層を微小透析容器に移し、核酸透析膜で密閉し、液体の漏れを防ぐために固定リングで固定しました。その後、微小透析装置を40 mLのスクリーニングバッファーで満たされた50 mL遠心チューブに配置し、SSDNAで構成される二次ライブラリの透析と抽出を促進するために4°Cで一晩インキュベートしました。二次ライブラリの濃度は、Nanodrop 2000分光光度計を使用して測定されました。
9ラウンドのスクリーニングは、前のラウンドのセカンダリライブラリが後続の各操作の開始ライブラリとして機能する磁気ビーズセレックス技術（図1）を使用して実施されました。プロセス全体でスクリーニングされたアプタマーの親和性を高めるために、各ステップのインキュベーション期間は徐々に減少しました。スクリーニングの第2ラウンドから、H1N1 HAタンパク質を逆スクリーニングに使用しました。表2は、標的タンパク質とSSDNAのインキュベーションパラメーターと濃度を示しています。
図1
インフルエンザBウイルスHAタンパク質に対してアプタマーを選択するためのビーズ – ゼレックスプロセスの概略図。高親和性アプタマーの最初の選択には、SSDNAライブラリを使用することが含まれます。アプタマーライブラリーは、最初にH1N1 HAタンパク質と結合した磁気ビーズにさらされます。ビーズにバインドするシーケンスは、洗浄プロセスにかけられ、その間に非固有の配列が削除され、特異的に結合した配列のみが取得され、精製されます。その後、ライブラリはPCRを介して増幅され、DNA収量が増加します。この手順は、インフルエンザBウイルスのHAタンパク質にリンクされた磁気ビーズを使用して繰り返され、それによってその後のサイクルのバックアップライブラリを作成します
表2インフルエンザBヘマグルチニンに対するアプタマーの選択のためのSELEXプロセスにおけるssDNAおよび標的タンパク質の量
ハイスループットシーケンス
高スループットシーケンスは、各スクリーニングサイクルのQPCR結果を調べることにより実施されました。陽性スクリーニングの上昇傾向と陽性スクリーニングのより大きな保持率が観察されました。ハイスループットシーケンスを使用して濃縮ライブラリを分析した後、普遍的な生合成とその後のアフィニティテストによる合成のために特定のシーケンスが選択されました。
表面プラズモン共鳴（SPR）検出
SPRチップは、50 mmの水溶液を使用して3回洗浄しました。その後、活性化混合ソリューションを使用してチップをアクティブにしました。活性化後、HAタンパク質をpH 5.5（10 mM）に調整したNaAC水溶液で希釈し、最終濃度10μg/mLを獲得しました。希釈されたHAタンパク質を標的タンパク質チャネルに注入しました。注射時、標的タンパク質チャネルを塩酸エタノールアミンで密封しました（pH 8.5）。 HAタンパク質のカップリング量は、15,296 ruであると判断されました。チップを活性化混合物と再活性化し、その後、コントロールチャネルをエタノールアミン塩酸塩で密封しました（pH 8.5）。速度論的パラメーターは、SPR機器（GE Healthcare、Biacore T200）を使用して確立されました。アプタマーサンプルを緩衝液で希釈して勾配を作成し、その後、コントロールタンパク質チャネルとターゲットタンパク質チャネルを連続的に通過しました。各サンプルは、1 M NaClを使用して再生されました。
直接ELISAによるアプタマー特性の分析
潜在的なアプタマーの特異性と親和性（解離定数（kd））をELISAを使用して決定しました。タンパク質を指定された濃度に希釈し、96ウェルプレートにカプセル化し、4°Cで一晩インキュベートしました。これに続いて、プレートは洗浄バッファーで徹底的にすすいだ。閉鎖溶液を各ウェルに分配し、37°Cで2時間インキュベートしました。その後、井戸からの液体を除去し、希釈されたアプタマー溶液を各ウェルに導入しました。次に、プレートをプレートシール膜で密封し、37°Cでさらに1時間インキュベートしました。プレートをすすいだ後、各ウェルに希釈したアビジン-HRP溶液（1:99の比に希釈する酵素コンジュゲート）を各ウェルに加えました。プレートをプレートシール膜で封じ込め、37°Cでさらに1時間インキュベートしました。 Unbound Avidin-HRPは、各ウェルを洗浄することにより除去され、その後、基質溶液を加えてプレート膜を密封しました。その後、色は37°Cで10〜15分間開発されました。実際の色の発達に基づいて終了溶液を追加し、プロセスが30分を超えないようにしました。各ウェルの吸光度は、450 nmの波長で酵素標識を使用して測定され、結果はOD値として表されました。 GraphPad Prism 9を使用してデータ分析を実行しました。 y = bmaxx/（kd+x）、ここで、Xはアプタマー濃度を表し、YはOD値です。 KD値は曲線から計算されました。
特異性を特定するために、前述のプロトコルを軽微に調整しました。標的タンパク質の濃度を25μg/mLに調整しました。アプタマー配列を合成および精製しました。製造業者のガイドラインに従って、アプタマーをヌクレアーゼを含まない水で希釈し、さらに使用するために-20°Cでアリコートを保存しました。インフルエンザB HA、H1N1 HA、およびBSAタンパク質の選択されたアプタマーの特異性を決定し、各ウェルの吸光度をELISAを使用して450 nmで測定しました。すべての測定値は3回実行され、平均値からの平均値、標準誤差、および標準偏差が結果を報告するために使用されました。
統計分析
すべての統計分析は、Windows用のGraphPad Prism 9.1.0を使用して実行されました（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）。アプタマー全体のOD450の違いは、両側のt検定、ANOVA、およびKruskal – Wallisテストを使用してテストされました。 KDの非線形曲線フィッティング分析が実行されました。アプタマーのKD値は、450 nmでその吸光度を測定することにより決定されました。データは、平均±標準偏差として表されます。違いは統計的に有意であると考えられていましたp≤0.05。
#インフルエンザBウイルスヘマグルチニンタンパク質に対するSSDNAアプタマーの選択と同定 #Virology #Journal