ニューデリーのCSIRゲノム統合生物学研究所の科学者らは、従来のものよりも正確かつ効率的にDNAを改変できる強化ゲノム編集システムを開発した。 既存のCRISPRベースの技術。
CRISPR は、ウイルス DNA を認識して破壊することで感染を抑制する免疫システムの一部として、一部の細菌に自然に存在します。ノーベル賞を受賞した研究で、科学者たちはこの細菌の防御メカニズムを再利用し、高等生物のゲノムを編集する新しいアプローチを開発しました。
CRISPRのオフターゲット問題
現在、CRISPR-Cas9を使用することで、研究者は動物のゲノム内の特定のDNA配列を追加、削除、または変更することができます。このシステムは、次のようなさまざまな分野で使用されています。 農業 — 植物の栄養価を高め、収穫量を増やす — ヘルスケアでは いくつかの病気を診断する そして 遺伝性疾患を治療する。
CRISPR-Cas9 遺伝子編集ツールは、標的ゲノムの特定の部分を見つけて結合するように設計されたガイド RNA (gRNA) を使用します。gRNA は酵素 Cas9 を標的部位に誘導し、その後にプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) と呼ばれる短い DNA 配列が続きます。Cas9 は PAM 配列を認識して結合し、損傷した DNA の一部を切り取る分子ハサミとして機能します。これにより、細胞の DNA 修復システムが自動的に起動し、切り取られた部分を修復して正しい DNA 配列を挿入します。
しかし、CRISPR-Cas9システムは、ゲノムの意図した部分以外の部分も認識して切断することができます。このような「オフターゲット」効果は、 化膿連鎖球菌 細菌。科学者は、編集効率を犠牲にして、より忠実度の高い SpCas9 バージョンを設計することができました。
SpCas9 を FnCas9 に切り替える
これらの問題を克服するために、研究者たちはCas9酵素を研究している。 フランシセラ・ノビシダ 細菌。FnCas9と呼ばれるこのCas9は精度が高いですが、効率も低いです。
特異性を損なうことなくそれを強化するため、CSIR-IGIBのDebojyoti Chakraborty氏とSouvik Maiti氏が率いる研究者らは、FnCas9の新しいバージョンを改良し、設計した。
研究者らは、宿主ゲノム上のPAM配列を認識して相互作用するFnCas9のアミノ酸を改良した。「こうすることで、Casタンパク質とPAM配列の結合親和性を高めることができます」とチャクラボルティ博士は述べた。「Cas9はDNA上にさらに強力な配置で存在することができ、遺伝子編集の効率が大幅に向上します。」
研究者らは、強化されたFnCas9をより柔軟にし、アクセスが困難なゲノム領域を編集できるように設計した。「これにより、遺伝子編集の道がさらに開かれます」とチャクラボルティ博士は述べた。
酵素ジュース
酵素活性を測定する実験では、強化された FnCas9 は、改変されていない FnCas9 と比較して、標的 DNA をより高速に切断することが示されました。
CRISPR ベースの診断および治療ツールは、DNA 内の特定の単一ヌクレオチドの変化を認識するシステムの能力に依存しています。ヌクレオチドは DNA と RNA の構成要素です。各ヌクレオチドは、核酸塩基、リン酸基、糖で構成されています。DNA 内の各ヌクレオチドには、アデノシン、チミン、グアニン、シトシンの 4 つの核酸塩基のいずれかが含まれています。単一ヌクレオチドの変化とは、ゲノム内の 1 つのヌクレオチドだけを「修復」する必要がある場合です。
研究者らが強化された FnCas9 がゲノム内のそのような変化を特定する能力をテストしたところ、enFnCas9 は未修正の FnCas9 よりも優れていることがわかった。強化された FnCas9 ベースの診断は、FnCas9 と比較してほぼ 2 倍の数の変化をターゲットにすることができ、より多くの疾患を引き起こす遺伝子変化を検出する範囲が広がる。
遺伝性の失明に対する検査
チャクラボルティ博士のチームが強化されたFnCas9酵素の効率と活性の向上を示した後、ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所のインドゥマティ・マリアッパン氏が率いるチームは、この酵素の治療への応用の適性を調査した。
研究者らは、強化された FnCas9 を使用して、実験室の皿で培養されたヒトの腎臓細胞と眼細胞のゲノムを編集しました。この遺伝子編集は SpCas9 よりも高い速度で行われただけでなく、オフターゲット効果も無視できるほど小さいことが示されました。
研究チームは最終的に、強化FnCas9が遺伝性疾患の治療に有効な選択肢であるかどうかを検討した。研究チームは、遺伝性失明の一種であるレーバー先天性黒内障2型（LCA2）を引き起こす遺伝子変異を修正する酵素の効率をテストした。 RPE65 この遺伝子の異常により、網膜色素上皮特異的 (RPE65) と呼ばれるタンパク質の発現が失われ、重度の視力喪失につながります。
驚くべき効率
研究チームは、LCA2を持つ個体から皮膚細胞を分離し、 RPE65 研究者らは、この突然変異を解析し、これらの細胞を人工多能性幹細胞（iPSC）に再プログラムした。この細胞は、人体のあらゆる細胞に成長させることができる。研究者らがiPSCを目の網膜細胞に分化させたところ、細胞はごくわずかなレベルのRPE65タンパク質を発現した。
研究者らは、強化された FnCas9 酵素を含む CRISPR システムを個人の iPSC に導入し、このタンパク質の低レベルの原因となる変異を修正しました。編集された細胞の配列を解析したところ、CRISPR ツールによって変異が修正されたことがわかりました。編集された iPSC は、網膜細胞に分化したときにも、RPE65 タンパク質の正常なレベルを示しました。
マリアッパン博士は、研究チームは編集の効率に驚いたと語った。iPSC のほとんどが編集されており、研究者が個々の編集された iPSC からコロニーを育てたところ、2 つのコロニーで 100% の変異修正が見られた。
「我々はまた、全ゲノムをオフターゲット相互作用について調べたが、他のCas9タンパク質で見られるいくつかのヒットと比較して、大きな懸念事項ではない少数のヒットしか見つからなかった。 [we] 検査した」と彼女は付け加えた。
研究コミュニティが必要としていたもの
これまでの報告では、このような個人特有の網膜細胞を人間に移植し、LCA2 のような遺伝性の失明疾患を治療できることが示唆されている。
米国の研究者グループ 2024年5月6日に報告、 の中に ニューイングランド医学ジャーナル LCA2 に苦しむ人々の目に直接 CRISPR を注入する方法は、初期の臨床試験で成功を収めている。しかし、患者固有の幹細胞を編集し、変異を修正した細胞を患者に移植する方がより安全な選択肢だとマリアッパン博士は言う。「これにより、正確な編集をスクリーニングして確認することができるからです。」
「研究コミュニティはCRISPRシステムにこの精度を必要としていました」と、ニューデリーのジャワハルラール・ネルー大学の研究者で、CRISPRベースのツールを使って 遺伝性疾患をモデル化し研究する 「鎌状赤血球貧血やβ-サラセミアなどの疾患に効果があると、同氏は言う。このようなオフターゲット効果の低減は、CRISPRベースの治療法を使用して変異を修正する人々にとって非常に重要であり、「したがって、これは非常に歓迎すべきアプローチです。」
シン博士は、オフターゲット効果のない正確な酵素が切実に必要とされている一方で、送達システムも同様に優れていなければならないと付け加えた。シン博士によると、研究者は次に、このツールを標的細胞の核に正確に送達することに重点を置くべきだという。
インドのための治療法の開発
チャクラボルティ博士は、研究チームはシステムをさまざまな送達方法に適応させるとともに、enFnCas9 のサイズを縮小することに取り組んでいると述べた。「これらはすべて、今後の研究で明らかになるでしょう」と同博士は述べた。
チームはまた、複数の遺伝性疾患に対する治療薬の規模拡大と製造のため、インド企業数社と連絡を取っている。「これにより、非常に高額になる可能性のある外国企業からのライセンス取得をしなくても済むようになる。」
マリアッパン博士も同意した。「このような高精度のエディターに関する独自の知的財産により、我が国のような低・中所得国の人々にとって、より手頃な価格で新しい治療法を開発できる立場が強化されました。」
スネハ・ケドカーは生物学者からフリーランスの科学ジャーナリストに転身した人物です。