SNAFを使用したネオアンチゲンのスプライシング発見により、がん免疫療法の共通標的が明らかに

予測されたスプライシングネオアンチゲンペプチドの免疫原性は、以前に記載されているように決定されました(16、 79）。 つまり、白血球減少システム (LRS) (シンシナティ ホックスワース血液センター) のチャンバーから HLA 型 PBMC を Ficoll Hypaque 密度勾配遠心分離を使用して分離し、バイアルあたり 20 × 106 細胞に分注し、使用するまで液体窒素で凍結しました。 0 日目に PBMC を解凍し、24 ウェル プレートに 4 × 106 PBMC をプレーティングすることで単球由来 DC をセットアップするために使用しました。 細胞はDC培地中、37℃、5% CO2でインキュベートされました。 [RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 1% l-glutamine (200 mM) + IL-4 (1000 U/ml), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (800 U/ml)]。 4時間後、ウェルをリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回すすぐことにより、非付着画分を除去した。 付着細胞をDC培地中で7日間培養した。 7日目に、DC培地に溶解したペプチド(10μg/ml)をDCに負荷し、37℃、5%CO2でインキュベートした。 4時間後、1.5mlのDC成熟培地を添加した。 [RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, 1% l-glutamine, IL-4 (1000 U/ml), GM-CSF (800 U/ml), IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml), tumor necrosis factor–α (TNF-α) (10 ng/ml), and lipopolysaccharide (LPS) (30 ng/ml)]。 DC 成熟の 16 時間後、同じドナーの 1 × 106 PBMC を DC 培養物に添加することにより、ペプチドをロードした DC を使用して自己 PBMC を刺激しました。 DC と PBMC の共培養物を T 細胞培地で増殖させた [60% RPMI 1640, 40% Click’s medium supplemented with 10% FBS, 1% l-glutamine, IL-6 (100 ng/ml), IL-7 (10 ng/ml), IL-12 (10 ng/ml), and IL-15 (5 ng/ml)]。 培地の色の変化に基づいて、３日目と６日目に培地を交換した。 14 日目と 21 日目に T 細胞を採取し、新しい自己ペプチドを負荷した DC で刺激しました。 3ラウンドのT細胞プライミングの後、28日目にT細胞を回収し、ペプチドを負荷した721.221(221)単一HLA抗原標的細胞に対するIFN-γ応答について試験した。 標的細胞221.A*02:01、221.C*04:01、および221.C*08:01には、別のウェルに10μg/mlの関連ペプチドをロードしました。 221 個の標的細胞とペプチドを、10% FBS を添加した RPMI 1640 中で 37℃、5% CO2 で 4 時間インキュベートしました。 ペプチドをロードした 221 個の標的細胞（ペプチドの有無にかかわらず）を、ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) (50 ng/ml) の存在下、3:1 の比率で 37°C で 6 時間共培養しました。 10% FBS およびモネンシンを添加した RPMI 1640 中の 5% CO2。 PMAおよびイオノマイシン刺激(それぞれ1μg/ml)を陽性対照として使用した。 その後、細胞を回収し、細胞外 CD45-BV786 (BioLegend)、CD14-PerCP (ペリジニン クロロフィル タンパク質) (BioLegend)、および CD8-PE (BioLegend) について氷上で 30 分間染色しました。 メーカーの指示に従って CytoFix/CytoPerm キット (BD) を使用して細胞を固定および透過処理し、その後細胞内 IFN-γ-APC (アロフィコシアニン) 発現 (クローン 4S.B3; BioLegend) を氷上で 20 分間染色し、氷上で直接分析しました。 BD Fortessa フローサイトメーター。 CD45+CD14-CD8+IFN-γ+細胞の分析は、FlowJoソフトウェアを使用して決定されました。
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#SNAFを使用したネオアンチゲンのスプライシング発見によりがん免疫療法の共通標的が明らかに
2024-01-17 19:05:39