BK タンパク質と CaV1.3 タンパク質が ER、ER 出口部位、およびゴルジ体の膜でどのようにして近接するのでしょうか?最初の会合の起源を探るために、我々は 2 つのタンパク質が互いに近くで翻訳され、それがそれらの mRNA の共局在として検出できるのではないかという仮説を立てました (図 5A と B）。この実験は、培養中の INS-1 細胞から単一の mRNA 分子を検出するように設計されました。同じ細胞内の 3 つの mRNA を同時に画像化できる RNAscope 蛍光検出キットを使用してマルチプレックス in situ ハイブリダイゼーション実験を実行し、高解像度の共焦点顕微鏡で画像を取得しました。この潜在的な mRNA レベルの組織の特異性を厳密に評価するために、複数の内部対照を使用しました。 GAPDH mRNAは、チャネルmRNAとの空間的連携が知られていない高度に発現されたハウスキーピング遺伝子であり、転写物の豊富さによる非特異的共局在のベースラインコントロールとして機能しました。 BK mRNA 間の空間的近接性 (KCNMA1) および CaV1.3 mRNA (CACNA1D) は機能的に結合したチャネルに特有であったため、NaV1.7 mRNA (SCN9A）、INS-1細胞で発現される膜貫通ナトリウムチャネルですが、BKとは機能的に関連していません。これにより、観察された共局在が共有された発現コンテキストではなく特定の生物学的関係を反映しているかどうかを判断することができました。最後に、この近接性が BK 活性化に関連する他のカルシウム源にも及ぶかどうかをテストするために、リアノジン受容体 2 の mRNA を調べました (RyR2）、BK チャネルと構造的に相互作用することが知られている別の Ca2+ チャネル（リフシッツほか、2011）。これらのコントロールを合わせて、ランダムな空間的近接性、共有細胞内分布、または遺伝子発現レベルのアーチファクトから特定の mRNA 共局在パターンを区別するために選択しました。図 5—図補足 2 は、細菌 mRNA をプローブした INS-1 細胞からの蛍光シグナルが完全に存在しない画像 (ネガティブ コントロール、図 5—図補足 2A) と、これらの細胞内に存在すると予想される哺乳類 mRNA をプローブした INS-1 細胞の画像 (ポジティブ コントロール、図 5—図補足 2B) を示しています。プローブの特異性を、in situ ハイブリダイゼーションを実行することによって確認しました。 KCNMA1、 CACNA1D、 RyR2そして SCN9A トランスフェクトされていない細胞株での結果 (図 5 – 図補足 2C および D)。
BK mRNA (KCNMA1) および CaV1.3 mRNA (CACNA1D) 共局在化します。
(あ) 仮説の図: KCNMA1 そして CACNA1D mRNA は、同じ近傍で翻訳されるために非常に近接して存在します。 (B) RNAscope 実験による蛍光点の画像。 KCNMA1 マゼンタのmRNA、 CACNA1D シアンの mRNA、および GAPDH 緑色はmRNA。右、3 つの ROI の拡大図。 (C) mRNA密度の比較 KCNMA1、 CACNA1Dそして GAPDH。 (D) mRNA 存在量の相関プロット KCNMA1 そして CACNA1D セルごとに。 (E) mRNA 存在量の相関プロット KCNMA1 そして GAPDH セルごとに。 (F) 間の共局在の比較 KCNMA1 mRNA および mRNA CACNA1D、 GAPDHとスクランブルされた画像 CACNA1D。データ ポイントは n=67 セルからのものです。スケールバーの倍率は 10 μm と 1 μm です。データは、ダネットの多重比較検定を備えた通常の一元配置分散分析を使用して分析されました。
次に、次の間の近接性を比較しました。 KCNMA1 そして SCN9A。検出しました SCN9A 同じ細胞内で KCNMA1 見つかりました(図6A）。間の共局在化 KCNMA1 そして SCN9A わずか 18 ± 2% でした (図6C）、これは、で観察されたものよりも小さかった KCNMA1 そして CACNA1D (60%、 図5F）。注目すべきことに、以下の間で同等のレベルの共局在化が観察されました。 KCNMA1 そして SCN9A 両方向の転写物 (データは示されていない) であり、統計的に有意な差はありません。これらの発見は、mRNA の共局在の特異性を裏付けています。 KCNMA1 に近づく傾向があります CACNA1D するよりも SCN9A または GAPDHの特異性をサポートする KCNMA1 そして CACNA1D mRNAの会合。
BK mRNA (KCNMA1) および RyR-2 mRNA (RyR2) 共局在化します。
(あ) 代表的な共焦点画像 KCNMA1 および NaV1.7 (SCN9A）mRNA。 (B) 代表画像 KCNMA1 そして RyR2 mRNA。 (C) 間の共局在の比較 KCNMA1 mRNA および mRNA RyR2、 SCN9Aとスクランブルされた画像 KCNMA1。データ ポイントは n=67 セルからのものです。一元配置分散分析。スケールバーの倍率は 10 μm と 1 μm です。データは、ダネットの多重比較検定を備えた通常の一元配置分散分析を使用して分析されました。
この概念が他のチャネルにも適用できるかどうかを理解することを目的として、同じアプローチを使用して、BK チャネルを開くためにカルシウムを提供することが知られている 2 番目のタンパク質をテストしました。 BK チャネルと CaV1.3 チャネル間の結合と同様に、RyR2 も BK チャネルに構造的に結合することができます (リフシッツほか、2011）。 図6B 単一分子の in situ ハイブリダイゼーションの高解像度画像を示します。 RyR2 一緒に調べた KCNMA1 INS-1細胞内。同じ細胞集団の中で、 KCNMA1 そして RyR2 共局在率は 27 ± 3% で、これは 1.5 倍です。 SCN9A mRNA。私たちも評価しました RyR2 ランダム化されたコンピューター生成との共局在化 KCNMA1 mRNAシグナル。ランダム化された間で共局在化することがわかりました。 KCNMA1 そして本物の RyR2 本物の分析と比較して共局在性が 87% 低かった KCNMA1 そして本物の RyR2 (図6C）、それを示唆しています KCNMA1 と共局在するだけでなく、 CACNA1D だけでなく、他の既知のカルシウム源の mRNA も使用します。
かどうかをさらに調査するには、 KCNMA1 そして CACNA1D アクティブな翻訳の領域に局在化されています (図7A)、RNAscope ターゲティングを実行しました。 KCNMA1 そして CACNA1D BKタンパク質の免疫染色と並行して。この戦略により、INS-1 細胞における転写物とタンパク質の共局在を細胞内解像度で視覚化することが可能になりました。
BK mRNA (KCNMA1) および CaV1.3 mRNA (CACNA1D）微小翻訳複合体に共局在する。
(あ) 仮説の図: KCNMA1 mRNA は微小翻訳複合体に存在します。 (B) 代表画像 KCNMA1 マゼンタのmRNA、 CACNA1D シアンはmRNA、緑色はBKタンパク質。 (C) 共局在頻度の比較 KCNMA1 能動的な翻訳および微小翻訳複合体における mRNA。データ ポイントは n=57 セルからのものです。一元配置分散分析を統計分析として使用しました。スケールバーの倍率は 10 μm と 1 μm です。
活性なBK翻訳部位を直接評価することにより、新しく合成されたBKタンパク質がBKタンパク質と共局在するかどうかを判断することを目的としました。 CACNA1D mRNA シグナル (図7A）。共焦点イメージングにより、異なる微小翻訳複合体が明らかになりました。 KCNMA1 mRNA 点は BK タンパク質シグナルと重なり、隣接して位置していました。 CACNA1D mRNA (図7B）。定量分析の結果、全体の 71 ± 3% が KCNMA1 BKタンパク質シグナルと共局在しており、これはそれらが活発な翻訳中であることを意味します。興味深いことに、69 ± 3% は KCNMA1 アクティブな翻訳で共ローカライズされる CACNA1D (図7C）、BKとCaV1.3チャネルの間に機能的な微小翻訳複合体の存在が裏付けられています。
1768481042
#機能的に結合したイオンチャネルは合成の開始時に共集合を開始します
2026-01-15 12:15:00