1764053961
2025-11-25 06:49:00
補足資料 1: 補足図 1.ac、RHOA 発現状態に応じた集約乳がんデータセットにおける患者の OS (a)、RFS (b)、および DMFS (c) のカプラン マイヤー生存分析。の p 値はログランク テストを使用して決定されました。 d、e、SUM159細胞にFlag-RHOAプラスミドをトランスフェクトし、さまざまな濃度のグルコース(d)または乳酸ナトリウム(e)中で24時間培養し、続いて免疫沈降を行った。沈殿したタンパク質のKlaレベルをウェスタンブロットによって分析した。 f、g、MDA-MB231細胞(f)およびSUM159細胞(g)を、異なる濃度の乳酸ナトリウム中で24時間培養し、その後免疫沈降を行った。沈殿したRHOAのKlaレベルをウェスタンブロットによって分析した。 h、RAS スーパーファミリーの保存された G4 および G5 モチーフのアミノ酸配列ロゴ。 i、j、WT-RHOA、K118RまたはK162R変異体をSUM159細胞で発現させ、免疫沈降後にK118(i)およびK162(j)のラクチル化を測定した。 k、Klaは、Mb-Pyl Kla-RS/Pyl-tRNAペアを使用して、HEK293T細胞のRHOA-K118またはK162TAG-EGFPに選択的に組み込まれました。緑色蛍光 (下) および明視野 (上) 画像を取得して、2 mM Kla の非存在下または存在下での EGFP の発現を確認しました。 １、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＫｌａがＦｌａｇ−ＲＨＯＡ−Ｋ１１８またはＫ１６２ＴＡＧに選択的に組み込まれた後、乳化ＲＨＯＡの発現をウエスタンブロット法により分析した。補足図2.a、b、ROCK2-RBD-HAは、HEK293T細胞でWT（WT）、ラクチル化（a）、または異なる変異体RHOA（b）と共発現し、免疫沈降したROCK2-RBD-HAをウェスタンブロッティングで検査しました。 c、精製GSTおよびGST-RBDはクマシーブルー染色によって検出されました。 d、WT-RHOAまたは異なる変異体をHEK293T細胞で発現させ、その活性をGST-RBDプルダウンアッセイによって測定した。 e、WT-RHOAまたはラクチル化RHOAを含むHEK293Tにおけるp-MLC2およびMLC2の発現をウェスタンブロッティングにより検査した。 f、MDA-MB231細胞およびSUM159細胞においてRHOA発現の安定したノックダウンが確立された。これらの細胞における RHOA 発現をウェスタンブロッティングによって分析しました。アクチンをローディングコントロールとして使用しました。 g、安定したWT-RHOAまたはK118Q変異体発現を有するshRHOA発現MDA-MB-231細胞におけるF-アクチンの相対蛍光強度をImageJを使用して分析した。 h、安定した WT-RHOA または K118Q 変異体発現を持つ shRHOA 発現 SUM159 細胞において、F-アクチンをローダミン ファロイジン (赤色) で染色しました。 i、リジンのラクチル化、リジンのアセチル化、およびグルタミンの構造図。補足図3。 a、G4 モチーフ内の K118 および G5 モチーフ内の K162 と GTP 結合 RHOA との相互作用 (PDB: 4XOI)。水素結合の相互作用は破線で示されています。 b, RHOA における K118 および K162 と GTP の相関は結晶構造によって表されます (PDB: 1FTN)。 c、WT-RHOA 結晶構造 (PDB: 1FTN; 黄褐色) とモデル化された WT-RHOA (空色) の重ね合わせ。 GDP と GTP 構造の拡大オーバーレイを右側に示します。 d、モデリング後のWT-RHOA（黄褐色）とK118Q（空色）、K118R（ピンク）、およびK118N変異体（薄緑色）の重ね合わせ。 GTP 構造の拡大オーバーレイを右側に示します。たとえば、WT-RHOA と K118Q (e)、K118R (f)、または K118N 変異体 (g) の間の MD 軌跡のタンパク質骨格 Cα RMSF プロットのオーバーレイとヒストグラム。 ｈ、ＧＴＰと精製ＲＨＯＡ、ＲＨＯＡ変異体（Ｋ１１８Ｑ）、またはＲＨＯＡ−Ｋ１１８Ｌａ（部位特異的グルタリル化システム由来）との間の結合活性を、ＧＴＰプルダウンアッセイによって測定した。 i、GTPとWT-RHOA、K118Q、K118R、またはK118N変異体との水素結合相互作用のヒートマップ。占有率は、特定の水素結合が存在するシミュレーション時間の比率として定義されます。補足図 4.a、K118 ユビキチン化を運ぶ代表的な RHOA ペプチドの MS/MS スペクトル。 b、WT-RHOAをHEK293T細胞で48時間発現させ、その後細胞を10μM MG132の存在下または非存在下で6時間処理した。細胞溶解物をウェスタンブロッティングによって分析しました。 c、CHXアッセイでは、WT-RHOAまたはK162変異体発現を有するshRHOA発現SUM159細胞を25μg/mL CHXで示された時間処理した。 RHOAの発現レベルをウエスタンブロッティングにより調べた。 d、Flag-RHOAをHA-ユビキチンとともにHEK293T細胞に同時トランスフェクトした。免疫沈降した RHOA のユビキチン化を測定しました。 e、HEK293T細胞を示されたプラスミドで同時トランスフェクトし、K118R変異体のユビキチン化をユビキチン化アッセイによって測定した。 f、ボックスプロットは、2つのデータセット（MEBTABRICおよびGSE25066）からの乳がんの異なるサブタイプにおけるKCTD13 mRNA発現を示します。 g、KCTD13発現と化学療法感受性の間の関係についてのGSE25066データセットの分析。 hj、KCTD13発現状態に基づく乳がんデータセットおよびGSE25066データセットにおける患者のRFSおよびDMFSに関するカプランマイヤー生存分析。の p 値はログランク テストを使用して決定されました。 k、WT-RHOA、K162R変異体、または/およびKCTD13発現を有するHEK293T細胞の溶解物をFlag-M2アガロースによる免疫沈降に供し、その後それらの相互作用をウェスタンブロッティングによって分析した。補足図5.a、近接標識質量分析法(PL-MS)によって同定されたRHOA結合タンパク質の一部を示す表。 b、箱ひげ図は、MEBTABRIC データセットからの乳がんのさまざまな組織学的グレードにおける USP9X 発現を示します。 ce、USP9X発現状態に基づく、示されたデータセットにおける患者のOS、RFS、およびDMFSに関するカプランマイヤー生存分析。の p 値はログランク テストを使用して決定されました。 f、HEK293T細胞に示されたプラスミドを同時トランスフェクトし、RHOAのユビキチン化をユビキチン化アッセイによって測定しました。補足図6a、b、インビトロラクチル化アッセイを使用して、野生型RHOA-K118（a）およびRHOA-K162（b）、およびそれらの対応する部位変異体のラクチル化に対するPCAFの影響を調べました。 c、HEK293T細胞にRHOAおよび/またはAARSプラスミドをトランスフェクトし、汎Kla抗体を使用してRHOAのラクチル化レベルを測定しました。 d、HEK293T細胞はRHOAと共発現し、SIRTを示し、汎Kla抗体を使用してRHOAのラクチル化レベルを測定した。 e、HDAC3 mRNA発現状態に基づく、示されたデータセットにおける患者のカプランマイヤー生存分析。の p 値はログランク テストを使用して決定されました。補足図7.a、安定したWT-RHOA、K118Q、またはK162Q変異体を含むshRHOA発現MDA-MB231およびSUM159細胞からのコロニーの形成を測定した。データは、空のベクター細胞株のパーセンテージとして表されました（3回の別々の実験における平均値±SD）。 *p
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