hiPS細胞株の培養
ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) を Cauliscell Biotechnology から購入し、10 μg/μL ビトロネクチン XFTM (STEMCELL Technologies、07180) でコーティングした 6 ウェル プレートに播種し、mTesR Plus 培地 (STEMCELL Technologies、100–0276) で維持しました。細胞には毎日栄養を与え、Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies、100-0485) 溶液処理と機械的解離を使用して 4 ～ 5 日ごとに継代しました。
HCOの生成
Lancaster MA チームと STEMCELL Technologies が説明したように、当社は HCO を差別化しました [27]。最初に、Gentle Cell Dissociation Reagent を使用して、hiPSC を単一細胞懸濁液に解離させました。次に、サプリメント A を添加した STEMdiff 大脳オルガノイド基本培地 100 μL を 96 ウェル プレート (9000 細胞/ウェル) および 20 μM Rho 関連プロテインキナーゼ (ROCK) 阻害剤に播種しました。
培養の連続 2 日目と 4 日目に、サプリメント A (STEMCELL Technologies、08570) を添加した STEMdiff Cerebral Organoid Basal Medium 100 μL を添加しました。 5日目に培地をサプリメントBを添加したSTEMdiff脳オルガノイド基本培地に交換しました。7日目に胚様体をマトリゲル（Corning、354,277）に包埋し、CおよびDを添加したSTEMdiff脳オルガノイド基本培地を添加して3日間培養を維持しました。 10日目に、培地を成熟大脳オルガノイドであるEを添加したSTEMdiff大脳オルガノイド基本培地に交換し、持続培養のために固定トラックロッカー上に置きました。
ウイルス感染症
この研究では、HCoV-OC43 株 (VR1558、ATCC)、HCoV-NL63 株 (アムステルダム、NC_005831)、HCoV-229E 株 (VR740、ATCC)、HCoV-HKU1 株 (NO. KT779555、この株は私たちの研究室から分離されました) および ZIKV (SMGC-1) を使用しました。 HCO（45日目）を、ウェル当たり1つのオルガノイドを含む24ウェルプレートに移し、100 TCID50ウイルス液とともに6時間共インキュベートした。 PBS で 1 回洗浄した後、500 μL の成熟培地を添加して培養を継続しました。抗ウイルスおよび抗炎症治療グループでは、対応する薬物濃度培地を適宜置き換えました（レムデシビル 100、10、1、0.1、および 0.01 μM、NEC-1、40 μM、CDDO-Me、0.8 μM）。
組織培養感染量中央値 (TCID50)
試験対象のウイルス 10 μl を 10-1 から 10-8 の範囲で 10 倍段階希釈しました。希釈後、サンプルを、MRC5 細胞の単層で満たされた 96 ウェル プレートに順次接種し、各希釈ごとに 8 つの複製ウェルを用意し、100 μL のウイルス希釈液を各ウェルに添加しました。対照群を確立し、37℃、5% CO2の培養チャンバー内で2時間インキュベートしました。吸着後、上清を捨て、PBSでウェルを1回洗浄し、ウイルス維持液100μLを加えて培養を継続した。細胞変性効果 (CPE) の毎日の観察を顕微鏡下で 4 ～ 5 日間実施し、各ウェルの CPE 状態を記録しました。 TCID50 は、Reed-Muench 法を使用して計算されました。
リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR)
RNA抽出とRT-qPCR分析を各条件と時点で実施しました。 HCO の細胞内の核酸は、Heaven’s Root Cell Nucleic Acid Extraction Kit を使用してメーカーのプロトコールに従って抽出されました。 cDNA合成は、メーカーの説明書に従って、500 ng〜1 μgのトータルRNAを使用して、SuperScript IIIおよびランダムヘキサマーを使用して実行されました。 TB Green Premix Ex TaqTM II (Takara、RR820A) キットを使用して、ウイルス核酸、TJU1、MAP2、PAX6、CTIP2、TBR1、TBR2、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、カスパーゼ 3、Fas、および Apaf1 の相対発現レベルを検出しました。メーカーの説明書。 ΔCt 値を計算するための参照遺伝子としてアクチンを使用し、ΔΔCt 値を計算するためのキャリブレーターとして未処理のサンプルを使用して、定量化を Excel で実行しました。データは倍率変化 (2-ΔΔCt) として表されました。 RT-qPCR に使用されるプライマーは表 S1 にリストされています。
核酸は、細胞培養上清核酸抽出キットを使用して抽出されました。続いて、One Step PrimeScript RT-PCR キット (Takara、RR064A) および LightCycle96 リアルタイム蛍光定量 PCR 装置 (Roche、バーゼル、スイス) を使用して、ウイルスの核酸のコピー数を決定しました。
細胞生存率の検出
この研究では、細胞生存率の検出に LDH 法が使用されました。 LDH 細胞毒性アッセイ キットは Abcam (ab65393) から購入し、製造業者の指示に従ってテストを実施しました。
透過型電子顕微鏡
2% パラホルムアルデヒドおよび 2.5% グルタルアルデヒドを含む溶液を使用し、続いて 1% 四酸化オスミウムで固定し、段階的エタノールを使用して脱水し、PON812 樹脂に包埋しました。樹脂ブロックから切片（厚さ 80 nm）を切り出し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色しました。透過型電子顕微鏡を使用して極薄切片を観察し、画像を取得しました。
HCO の免疫染色
免疫蛍光染色では、ウイルスに感染した HCO を 4 日間固定するために 10% ホルマリン溶液を使用し、24 時間固定させました。切片をパラフィンに包埋してブロックを形成した。 5 μm のスライスを準備し、60 °C で 1 時間焼き、キシレン I、II、III、IV でそれぞれ 5 分間脱蝋し、続いて無水エタノール I および II でそれぞれ 2 分間、70% エタノールで 2 分間水和し、ddH2O に 5 分間浸漬しました。切片を、pH 6.0 または 9.0 の抗原抗体賦活化溶液に 90 °C を超える温度で 10 分間置き、その後自然冷却しました。 DPBSで1回洗浄した後、スライスを0.2% Tritonに10分間浸し、5% BSAで1時間ブロックし、1% BSAで調製した一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。次の一次抗体を使用しました: 抗 TUJ1 (STEMCELL Technologies 60,052、1:1,000)、抗 MAP2 (BD Biosciences 556320、1:500)、抗 CTIP2 (Abcam 18465、1:100)、抗 SOX2 (Abcam 171380、1:200)、抗 Ki-67 (NOVUS-NBP1-31,231、1:1,000)、抗 GFAP (Abcam 4648、1:100)、および抗 HCoV-OC43 NP (SinoBiological 40643-T62、1:500)。続いて、切片をDPBSで5分間ずつ5回リンスし、二次抗体調製物およびDAPIを含む1% BSAを含む溶液中で室温で1時間インキュベートした。次の二次抗体を使用しました:ロバ抗ラット Alexa 488 (Invitrogen-A-21208、1:1,000)、ロバ抗ウサギ Alexa 555(Invitrogen-A-31572、1:1,000)、ロバ抗マウス Alexa 647(Invitrogen-A-31571、1:1,000)、 DAPI (Invitrogen-A-22287、1:1,000)。スライスを DPBS で 5 回洗浄し、各浸漬を 5 分間継続し、50 μL の退色防止封入剤を添加して封止しました。画像は、共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8、ドイツ) を使用して取得されました。
アポトーシスの定量化
HCO のパラフィン切片を使用してアポトーシスを検出しました。前処理手順は免疫蛍光プロトコルと一致していました。アポトーシスは、TUNEL BrightRed アポトーシス検出キット (Vazyme、A113-01) を製造元の指示に従って使用して検出しました。画像は、共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8、ドイツ) を使用して取得されました。
RNA配列決定
HCoV-OC43 実験の RNA シークエンシングと分析では、条件および時点 (1、4、および 14 dpi) ごとに 3 つの複製を使用しました。 TRIZOL メソッドを使用して細胞内核酸を抽出し、RNA サンプルは Agilent 2100 バイオアナライザーを使用して厳格な品質管理を受け、RNA の完全性を正確に評価しました。真核生物のほとんどの mRNA がポリ (A) テールを持っていることを考慮すると、オリゴ (dT) 磁気ビーズ濃縮によってポリ (A) テールが濃縮された mRNA が得られました。続いて、NEB 断片化バッファー内の二価カチオンを使用して mRNA をランダムに断片化し、続いて NEB 標準または鎖特異的ライブラリー調製方法を使用してライブラリーを構築しました。 [33]。ライブラリの構築が完了したら、Qubit 2.0 Fluorometer を使用して最初の定量を実行し、続いてライブラリを 1.5 ng/μL に希釈しました。その後、ライブラリーのインサート サイズの分析を、Agilent 2100 バイオアナライザーを使用して実施しました。予想されるインサートサイズを確認したら、RT-qPCR を使用してライブラリーの有効濃度 (有効濃度 > 1.5 nM) を正確に定量し、ライブラリーの品質を確保しました。
ライブラリーが品質管理に合格すると、有効濃度とイルミナのシーケンスに必要なターゲット データ量に応じてプールされます。
RNA-seqデータ解析
血液脳関門（BBB）とHCOの共培養モデルの確立
ヒト脳内皮 (HBEC) は ATCC (バージニア州、米国; CRL-3245) から購入し、ヒト星状細胞腫は ATCC (バージニア州、米国; CRL-1718) から購入し、ヒト脳血管周皮細胞は iXCells Biotechnologies (米国カリフォルニア州サンディエゴ; 10HU-031) から購入しました。 Sean N. Avedissian と Saoirse E. O ‘Sullivan のチームによる BBB 構築のプロトコルを参照しました。異なる種類の細胞を適切な時期に接種しました。細胞を Transwell (Corning, 3462) で 10 日間培養したとき、HCO を Transwell と共培養して共培養モデルを得ました。 [36, 37]。
経上皮電気抵抗 (TEER) 測定
抵抗測定プローブを 75% (v/v) エタノールで洗浄し、風乾し、バイオセーフティキャビネット内で 15 分間内皮培地中で平衡化しました。平衡化後、プローブをトランスウェルインサートウェルに配置し、短いアームを頂端層のHBECのすぐ上に配置し、長いアームをウェルの底のカバースリップのすぐ上に配置しました。一貫した測定を保証するために、プローブの位置はすべてのトランスウェル プレートで同一に保たれ、トランスウェルごとに少なくとも 3 つの位置を測定して TEER を決定しました。 TEER 値は実験が完了するまで毎日記録されました。
FITC-Dextran の浸透率を検出
BBB 透過性を測定するための信頼できる方法は、Reka Natarajan のグループを参照して実施されました。 [38]、100μg/mLのFITC-デキストランを含むDMEM/F12（フェノールレッドなし）を頂端側に適用し、30分間インキュベートした。続いて、10 μL の培地を頂端および基底コンパートメントの両方から収集し、100 μL の PBS をあらかじめ充填しておいた黒色の 96 ウェル プレートに移しました。蛍光強度は、マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長494nmおよび発光波長521nmで測定した。 FITC-Dextran の透過性は、次の式を使用して蛍光強度から計算されました:透過性 = (頂端蛍光強度/基底蛍光強度) × 100%。
BBBの免疫染色
HCoV-OC43 感染 BBB 細胞を in situ 4% パラホルムアルデヒドで少なくとも 8 時間固定し、0.2% Triton X-100 で透過処理し、5% BSA でブロックし、抗 GFAP タンパク質抗体 (CST 80788T、1:100)、クローディン 5 抗体 (ThermoFisher 35-2500、1:100) と反応させました。 CD146 抗体 (Abcam ab75769、1:100)。二次抗体のインキュベーション後、錠剤を密封し、写真を撮影した。サンプルは、レーザー走査型共焦点顕微鏡システム (Leica TCS SP8、ドイツ) で検出および記録されました。
統計分析
データは、測定ごとに異なるドットを使用して平均値 ± SD として表されます。対応のない t 検定を使用して、2 つのグループ間の差異を比較しました。一元配置分散分析を使用して、3 つ以上のグループを比較しました。 p
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