細胞培養
この研究では、4つのHNC細胞株が使用されました。SCC78（UPCI：SCC078）（RRID：CVCL_C044）、アルコールとノンコーカーの病歴を持つ男性患者のTP53変異的でHPV陰性の口扁平上皮癌細胞株の床。 SCC143（UPCI：SCC-143）（RRID：CVCL_C057）、TP53 WTおよびHPV陰性の口の床扁平上皮癌細胞株は、アルコール歴のない女性患者と喫煙者。 SCC154（UPCI：SCC-154）（RRID：CVCL_2230）、男性患者の舌扁平上皮癌細胞株のTP53 WTおよびHPV16陽性細胞株ベース。およびFADU（RRID：CVCL_1218）、アルコールと喫煙者の既往歴のある男性患者からのTP53ミューティングおよびHPV陰性の下咽頭扁平上皮癌細胞株。 HELA細胞株（CCL-2 ATCC）（RRID：CVCL_0030）は、女性患者のHPV18陽性頸部腺癌細胞株であり、HPV陽性コントロールとして使用されました。 TP53変異細胞株SCC78およびFADUは、次の突然変異を示しました：R150G C.884 C> G（p。Arg282gly）（18、19）、およびc.676-1G> a（p。Stopat 244）66。 SCC78、SCC143およびSCC154細胞は、ピッツバーグ大学（UPCI：SCCS）67から取得され、FaduおよびHeLa細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入しました。
HNC細胞株は、10％胎児ウシ血清、1％抗生物質 – アンチミコシス溶液、1％グルタマックスを添加したDulbeccoの修正eagleの培地（DMEM）で成長させ、HeLa細胞を37°Cで5％CO2で最小必須培地（MEM）で成長させました。セルは8つの通路で培養され、初期の通路からのアリコートが使用されました。
細胞生存率と増殖アッセイ
シスプラチンのIC50を決定する（CAS 15663-27-1）（メルクKGAA、ドイツ、ダルムシュタット）（232120）およびTAK242（CAS 243984-11-4）（メルクKGAA、ダルムシュタット、ドイツ）（614316） 0〜50 µMシスプラチンまたは0-250 µM TAK242の範囲の連続希釈液は、TAK242のビヒクル（DMSO）を実験の制御として使用しました。細胞生存率を分析するために、96ウェルプレートに2500個の細胞をウェルごとに播種しました。 24時間後、細胞を10 µg/ml LPS（製造業者の推奨用量）（から得たリポ多糖で処理しました 大腸菌 055：B5）（L6529）（Merck Kgaa、Darmstadt、Germany）、対応するTAK242またはシスプラチンIC50、LPS（10 µg/mL） +シスプラチンIC50の組み合わせまたはTAK242 IC50 + Cisplatin ICPlatin ICPlatin ICPlatin ICPlatin ICPLATIN ICPLATINIC50の組み合わせ。 72時間の治療後、10 µLのプレストブルー細胞生存可能性試薬（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国）（A13261）が追加されました。プレートを1時間30分間インキュベートし、蛍光を570（励起）nmおよび600 nm（排出）で測定しました。 IC50値の決定と、Tukey’sおよびDunnettの多重比較テストを用いた通常の一方向ANOVA統計分析は、GraphPad Prism 8ソフトウェア（RRID：SCR_000306）（GraphPad Software、Inc。、California、USA）を介して実行され、TAK242とCisplatinの組み合わせインデックスは、Calcusyn Software（RRID：110251）を介して補足されました（RRID：110251） Biosoft Bioinformaticsソフトウェアプラットフォーム）少なくとも4つの複製。
増殖アッセイの場合、次の細胞を24ウェルプレートに播種しました：3×104、1×104、4×104、および1×104のSCC78、SCC143、SCC154、およびFADU細胞。翌日、細胞を10 µg/mL LPS、またはTAK242の対応するIC50で処理しました。 24時間、48時間、および72時間の治療後、生存細胞をノイバウアーチャンバーおよびトリパンブルー試薬（Merck KGAA、Darmstadt、Digmany）（V900876）を介してカウントし、Dunnettの多重比較テストを使用した双方向ANOVA統計分析は、GraphPad Prism 8ソフトウェアを介して少なくとも4つのレプリケートを使用して実行されました。
コロニー形成アッセイ
細胞を低コンフルエンスで播種し、6ウェルプレートにウェルあたり500個の細胞を播種しました。翌日、細胞を10 µg/mL LPSまたはTAK242の対応するIC50で処理しました。 72時間後、培地を除去しました。 10〜15日間の治療後、細胞をメタノールで固定し、20％メタノール中の0.5％結晶バイオレットで染色しました。セルで覆われたプレート面積の割合は、ImageJ 1.53K（RRID：SCR_003070）（国立衛生研究所、メリーランド州、米国）ソフトウェア、およびTukeyの多重比較テストを使用した通常の一元配置分析分析を介して測定されました。
ウエスタンブロット
細胞は、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.5％NP40、0.1 mM EDTA、および完全なミニエッタを含まないプロテアーゼ阻害剤コックタイルを含むタンパク質抽出バッファーを介して溶解しました（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）（11836170001）。抽出後、タンパク質をクイックスタートBradford Dye Reagent（Bio-Rad Laboratories、Inc。、California、USA）（＃5000205）を介して定量化し、100 µgのタンパク質サンプルをSDS-PAGE（10〜12％アクリルアミドゲル）を介して西部ブロッティングを介して分析しました。
次の一次抗体が使用されました：抗TLR4（1：100）（AB13556）（RRID：AB_300457）（ABCAM、ケンブリッジ、イギリス）、抗P16（1：1000）（SC-56330）（RRID：AB_785018）（Santa Cruz biotechnology、Texas、Antexas、Antechnology」 （1：5000）（2148 s）（米国マサチューセッツ州マサチューセッツ州の細胞シグナル伝達技術）、抗アルファチューブリン（1：200）（PAS-16891）（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国）、Anti-NFκB（1：200）（AB7972）（ABCAM、Cambridge、UK）Antibodies。次の二次抗体が使用されました：抗ウサギ（1：5000）（7074 s）（セルシグナル伝達技術、マサチューセッツ州、米国）および抗マウス（1：5000）（7076秒）（7076秒）（セルシグナル伝達技術、マサチューセッツ州、米国）抗体。
細胞死分析
細胞死分析は、アネキシン-V、7AAD、および活性化されたカスパーゼ-3/7染色細胞を測定することにより、フローサイトメトリーを介して実行されました。この実験では、2×105セル（SCC143、SCC78、およびFADU）または1×105セル（SCC154）を6ウェルプレートに播種しました。 24時間後、細胞を10 µg/mL LPS、IC50のそれぞれのTAK242またはシスプラチン、または両方の組み合わせで処理しました。 After 72 h of treatment, apoptotic and necrotic cells were detected via the eBioscience Annexin V-FITC Apop Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) (88-8005-72), and active caspase-3/7 -positive cells were stained via the CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) （C10423）、どちらもメーカーのプロトコルに続きます。細胞は、BD FACSCALIBUR（BD Life Sciences、ニュージャージー州、米国）を介してフローサイトメトリーを介して分析され、集団はFlowJo V.10ソフトウェア（RRID：SCR_008520）（SCR_008520）（ ）（Flowjo LLC、オレゴン州、米国）。アポトーシス細胞は、アネキシン-V +/7AAD-およびアネキシン-V +/7AAD +染色を伴うものと見なされ、壊死細胞はアネキシン-V-/7AAD +染色を伴うものと見なされました。 Tukeyの多重比較テストを使用した通常の一方向ANOVA統計分析は、少なくとも5つの生物学的複製を伴うGraphPad Prism 8ソフトウェアを介して実行されました。
創傷治癒
まず、次の細胞をさまざまな用量のマトマイシンC（CAS 50-07-7）で処理しました（Merck Kgaa、Darmstadt、Germany）（10107409001）：0.25 µg/ml、0.5 µg/ml、およびFaduの1 µg/ml。 SCC143で0.75 µg/mLおよび1 µg/mL。 SCC154で0.125 µg/mLおよび0.25 µg/mL。細胞増殖アッセイを実施して、どの用量のマトマイシンが増殖を阻害できるかを評価しました（補足図3a）。その後、細胞周期停止は、対応する用量（FADUで0.25 µg/ml、SCC143で1 µg/ml、SCC154で0.125 µg/mL）で2時間のマトマイシンC治療後に評価されました（補足図3A-C）。
創傷治癒アッセイのために、24ウェルプレートで細胞を高コンフルエンス（SCC143の1×105セル、SCC154およびFADU細胞の4×105セル）で播種しました。 24時間後、プレートを次の濃度でマトマイシンCで2時間処理しました。 SCC143の1 µg/ml; SCC154で0.125 µg/mL。マトマイシンCを含む培地を廃棄し、プレートの各井戸の中央で傷を作った。次に、細胞を10 µg/mL LPSまたはTAK242 IC50で処理しました。プレートは、Zeiss Axio Observer Z1（Carls Zeiss AG、Jena、Germany）顕微鏡で監視され、24時間2時間ごとに画像をキャプチャしました。ピクセルのギャップの面積は、ImageJ 1.53Kソフトウェア（米国メリーランド州国立衛生研究所）で測定され、Dunnettの多重比較テストを使用した通常の一方向ANOVA統計分析は、少なくとも5つの生物学的複製を備えたGraphPad Prism 8ソフトウェアを介して実行されました。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（QPCR）
RNA抽出のために、2×105セルのSCC78とSCC143を6ウェルプレートに播種しました。 24時間後、細胞をDMSO（車両）または特派員TAK242 IC50で処理しました。 48時間後、製造業者が説明するように、RNAをTRIZOL試薬（Thermo-Fisher Scientific、Massachusets、USA）で抽出しました。 After, 1 µg of RNA was treated with DNase (RQ1 RNase-Free DNase) (Promega, Winsconsin, USA), followed by cDNA synthesis with SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo-Fisher Scientific, Massachusets, USA), and qPCR with Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo-Fisher Scientific, Massachusets, USA), also following the manufacturer’s protocol.使用されるプライマーは次のとおりです。RPLOF5′-CCTCATATCCGGGGGGAATGTG-3 ‘; rplo r 5’-gcagcagctggcaccttattg-3 ‘; p21 r 5’-tggagtggtagaatctgtcatgc-3 ‘; P21 F 5’-GGACAGGAGAGAAGACCATGT-3 ‘; tp53 r 5’-tggtttttttttgctgggg-3 ‘; TP53 F 5’-GCGTGTTGTGCCTGTCCTG-3 ‘; MKI67 R 5’-TGAAATAGCGATGTGACATGTGCT-3 ‘; MKI67 F 5’-TGTGCCTGCTCGACCCTACA-3 ‘; IL6 F 5’-CCACACAGACAGCCACTCAC-3 ‘; Il6 r 5’-Aggtttttttccccagtgc-3 ‘。データは、RPLO発現と比較してΔCT、ΔΔCT、および折り畳み変化を計算し、3つの生物学的複製を備えたGraphPad Prism 8ソフトウェアを介して実行されたT検定統計分析を実行しました。
#頭頸部癌細胞株におけるTLR4阻害の抗腫瘍効果