遺伝的に設計されています anopheles coluzzii
遺伝的に操作されたACTP13株 an。 coluzzii これらの実験で使用されたのは、UCアーバインのジェームズラボによって開発および説明されました [8]。宝石株は、最初はドライブシステムのMOPTIへの遺伝子移入によって作成されました an。 coluzzii BEI（BEI Resources、Manassas、VA、USA）からの株（MRA-763）;したがって、MOPTI株は、このレポートに記載されている研究のWTコントロールとして使用されました。 ACTP13 GEMには、単一鎖可変フラグメントモノクローナル抗体を標的とする2つのエフェクター遺伝子が装備されています 熱帯熱マラリア原虫 OokineteおよびSporozoiteの段階で [8]。これらのエフェクター遺伝子は、血の食事に続いて成体雌で最も強く発現しています [8]、したがって、成人の半肉体または重力 an。 coluzzii 捕食者の食事に使用されました。
捕食者
蚊の2つの捕食者種の未熟段階 ガンブシ関連 （図1a）および太字のジャンプクモ ジャンプボールド （図2a）この実験では選択されました。この期間中の成長は、個人が性的成熟に向けて進行するにつれて急速かつ予測可能に発生するため、未熟段階が使用されました。
図1
ガンブシ関連 形態学的特性と測定。 a 少年 G.アフィニス 区別できないセックスの。 b 魚の長さは、口の先端から尾びれの底までの1 mm×1 mmグリッドで背側に測定されました（黄色の矢印）。 c 性的差別化 G.アフィニス 黒い重力スポットと丸みを帯びた体と成人の男性（右）を示す成人の女性（左）で表示されます。
図2
ジャンプボールド 特性と測定。 a 少年 A.太字 表現型の性的特性を示さない。の定義された測定値（b）カラペース幅と（c）眼の直径の中央値
Mosquitofish： ガンブシ関連
重大な成虫 G.アフィニス 魚は、サクラメントヨーロ蚊とベクターコントロール地区（8631 Bond Rd Elk Grove、CA 95624）から取得されました。各雌は、コンディショニングされた水道水で満たされた6 lの出産タンクで分離され、酸素化用の空気石を装備しました。各墓雌は、タンク内のスクリーン外の出産室に置かれました。スクリーンは、大人の女性を含む際にフライが泳ぐことを許可することで共食いを防ぎました [41]。成人の女性は、出産した後、チャンバーから除去されました。フライは兄弟と共同で兄弟と共同で育てられ、ヒカリに最初の噛み魚の食物顆粒（米国カリフォルニア州サンディエゴ）AD Libitum Dailyを与えました。 2週間後、2人の別々の母親からの子孫は、2人の割り当てられた食事療法グループ間で均等に分割され、子孫は食事グループごとに合計40人でした。次に、魚を、酸素化用のエアストーンとジャンプを防ぐためのスクリーニングされた蓋を備えた500 mLのコンディショニングされた水道水で満たされた700 mLのプラスチック容器で個別に飼育しました。
大人ですが G.アフィニス 水の表面から成体の蚊を容易に食べると、生産生蚊に生産物を幼い魚に供給しようとする試みは、少年の小さなサイズのために失敗しました。 G.アフィニス ダイエットは、略奪的なダイナミクスを正確に再現するのではなく、高レベルの発現GEM抗体を含めるように設計されました。 G. affinisとan。 coluzzii。したがって、成体の蚊を凍結乾燥させ、ヒカリの最初の咬傷と混合して、魚の食物顆粒（米国カリフォルニア州サンディエゴ、ペトコ）を準備します。 G.アフィニス ダイエット。肉食、非グラビッド、および雄蚊の混合物を含む成体蚊のケージを使用して、食事を準備しました。 anopheles 前の夕方に血が育まれました G.アフィニス ダイエットの準備が始まりました。未解決の生きた成人のケージを-20°Cフリーザーに30分間置きました。凍結蚊の各ケージを、-20°Cで最大2時間保存した15 mLチューブに注ぎ込んだ。各チューブは、Labconco Freezone 2.5と凍結乾燥剤（Labconco、カンザスシティ、米国）を使用して24時間凍結乾燥しました。最終的な宝石とWTダイエットの混合物に同じ割合の重大な雌の蚊が含まれていることを確認するために、3つのパラメーターが記録されました。（1）個々の凍結乾燥雄、ノングラビッドの女性、およびそれぞれの株の重大な雌蚊の平均質量、（2）蚊タイプの比率（2）それぞれの雌のマサチの比率、および（3）、および雄のマサチケージごとに凍結乾燥した蚊。各蚊タイプの平均質量を決定するために、各株からの50個の男性、非グラビッド、および重大な雌を個別に凍結乾燥させ、各タイプの個々の平均質量を計算しました。凍結乾燥の前に、各ケージからの約150の蚊のサブサンプルを、ケージあたりの蚊タイプの分数比を推定するために、男性、非視力雌、重力の雌に分類されました。最後に、各ケージを凍結乾燥させた後、すべての凍結乾燥した蚊を計量して、総ケージ質量を決定しました。
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ケージあたりの推定重力雌の総数雄（（{ varvec {f}} ））の分数比（（{ varvec {m}} ））、nongravid雌（（{ varvec {n}} { varvec {g}}}}} （（{ varvec {g}} { varvec {f}} ））、および凍結乾燥ケージの総質量（（{ varvec {c}} ））。各蚊株の約16個のケージを処理して、68％の墓雌と32％の雄と非波動雌を含む蚊の混合物を産生しました。食事の混合物には男性と非グラビッドの雌も含まれていましたが、重力の雌はこの研究に関心のある遺伝的に操作されたタンパク質を発現するため、重力化雌の数が食事組成の基礎として使用されました。最終的な食事混合物は、凍結乾燥した蚊を粉砕し、魚の食物と混合して、粉末食品混合物14 mgあたり10人の墓雌の製剤を作成することにより調製しました。この混合物は、40％の重力女性、20％の非群雌と雄、および質量による40％の魚食でした。
週に一度、各魚について質量と長さの測定が収集されました。実験的な食事を開始する前に、1週間のゼロベースライン測定が行われました。質量を測定するために、各魚をそのエンクロージャーから、水を入れた30 mmのペトリ皿に移しました。ネットを使用して、魚を移動して、余分な水が魚の塊を変えるのを防ぎました。魚の質量は、最も近い0.1 mgに記録されました。計量した後、各魚は1 mm×1 mmグリッドの背景に写真を撮って、標準の長さを測定しました。標準長 [42] ImageJソフトウェアを使用して、口の先端から尾びれの基部まで背側に測定されました（図1B） [43, 44]。
7週間の実験中に、魚に週に2回宝石または蚊の食物混合物を与えられ、他のすべての日に魚の食物を提供しました。蚊の食物ミックスと魚の食品の毎日の配給は、平均魚の体重の約25％に毎週調整されました。平均して、魚は週に14.5匹の重力雌を消費しました。各容器の水は、週2回蚊の給餌の前に交換されました。魚の死亡率について毎日監視され（図3A）、性的分化の兆候について週2回観察されました（図3B）。重大な斑点を示す魚は女性に分類され、細長いゴノポディウムを持つ魚は男性に分類されました（図1C）。最初の7週間の期間の後、魚をさらに3週間飼育し、より多くの個人が性的差別化を達成できるように、ヒカリの魚に噛み付きました（図3B）。
図3
の毎週の測定 G.アフィニス 開発指標。 a 遺伝子組み換え蚊（GEM）ダイエットグループ（左）または野生型（WT）ダイエットグループ（右）および（（右）および（b）GEMダイエットグループ（左）またはWTダイエットグループ（右）の性的差別
ジャンプクモ： ジャンプボールド
2つの重力 A.太字 女性はJumpingspidersforsale.com（米国カリフォルニア州ガーデングローブ）から購入しました。各雌は、101.6 mm×101.6 mm×128.6 mmのエンクロージャーに収容され、週に2回クリケットとフルーツハエの食事を与えました。 hatch化は、hatch化後約1か月後、巣を離れ始めるまで、母親と同じ囲いに保管されていました。 2人の母親からの59の合計hatch化は、個々のエンクロージャーに配置され、2つの食事グループの間に均等に分布しました。性比は、少年の男性と女性のジャンプクモが形態学的に区別できないため、当初は不明でした（図2A）。
個々のエンクロージャーは12.5×5.5×5.5 mmで測定され、パリ基板と片側に貼られたコルクの樹皮の石膏が含まれていました。容器の側面と蓋に小さなスクリーン式の換気穴が提供され、蚊の獲物の導入を可能にするために、エンクロージャーの底に大きな詰め物がありました。エンクロージャには、週に3回水を噴霧しました。実験の開始前に、各少年クモに週に5回のフルーツハエに与えられました。 GEMまたはWT蚊の食事の最初の導入の前に、週0のベースライン測定が行われました。
実験中、クモには10人のライブ、半墓、女性の宝石またはwtのみを与えられました an。 coluzzii 蚊は週に1回11週間。各ダイエットグループに合計30のクモが使用されました。クモと残りの蚊をCO2で軽く麻酔し、給餌後48時間後に囲いから除去しました。囲いに残っている未食加工の蚊の数が記録され、すべての蚊、蚊の死体、およびクモの脱皮が除去されました。麻酔されたクモの重量は、甲羅の幅と眼の直径測定のために顕微鏡の下に配置された1 mm×1 mmグリッドグリッドの背景に撮影され、1 mm×1 mmグリッドの背景に撮影されました。写真をImageJソフトウェアを使用して分析して、甲羅の幅（図2B）と前の眼の直径（図2C）を取得しました。 [40, 43]。死亡率は週に2回監視されました。
摂食実験が完了した後、 A.太字 さらに3週間個別に収容され、週に15個のフルーツハエの食事を与えました。その後、クモは安楽死させ、エタノールで保存されました。保存されています A.太字 個人を形態学的に検査して性別を決定しました。男性は、pedipalpsにパルパル電球の存在を介して特定され、雌は腹部の下側にepigynumの存在を介して同定されました。最後から2番目または成人の齢に到達しなかった個人は、安楽死の時点で区別できない形態学的性的特性を持ち、未知の性別として記録されました。
分析
標準偏差（SD）は、GEMグループとWTグループの違いを評価するために計算されました。双方向の分散分析（ANOVA）を使用して、食事グループ、性別、および捕食者の成長に対する相互作用の影響をテストしました [45]。 ANOVAの結果に続いて、Tukeyの正直な有意差後検定を使用して、性別（女性、男性、または不明）の成長が大幅に異なるかどうかを判断し、2つの食事グループ全体で同性の個人間で成長が異なるかどうかを判断しました。フィッシャーの正確なテスト [46] 死亡率が大幅に異なるかどうかを判断するために使用され、カイ二乗検定 [47] 性比が大きく異なるかどうかを判断するために使用されました。すべての分析は、Rバージョン4.4.2で実施されました [48] 統計的生成と分析のために、rstatix、dplyr、ほうき、およびPurrパッケージを使用してください [49,50,51,52]、プロット作成用のGGPLOT2パッケージ [53]、およびプロットにおける統計的統合のためのGGPUBR [54]。 a p-の値
#遺伝的に設計された蚊の食事を与えられた2つの捕食者種の成長と発達寄生虫とベクトル