倫理声明
動物実験のプロトコルは、上海動物疾病管理センターの実験動物倫理委員会によって承認されました。
系統解析
2019年に上海で分離された6つのH3N2 CIV分離株（A/canine/China/Shanghai/0103/2019、A/canine/China/Shanghai/0104/2019、A/canine/China/Shanghai/0105/2019、A/canine/China/Shanghai/018/2019、A/canine/China/Shanghai/019/2019、A/canine/China/Shanghai/0114/2019）のヘマグルチニン（HA）遺伝子が、遺伝学的および系統学的解析に使用されました（アクセッション番号：MK758007.1～MK7580054.1）。配列データは、Lasergene配列解析ソフトウェア（Dnastar Inc.、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用してコンパイルおよび編集されました。 CLUSTAL Wを使用して多重配列アラインメントを実施しました。起源分析のための最大尤度ツリーは、1,000回のブートストラップ複製を使用してMEGA 4で構築されました。 [19, 20]。
ウイルスの増殖と電子顕微鏡
A/canine/Shanghai/0103/2019 (H3N2) は、中国上海の野良犬から分離されました。ウイルスは、9 日齢の特定病原体フリー (SPF) 発育鶏卵で 37 °C で 48 時間増殖させ、-80 °C で保存しました。ウイルス力価は、50% 卵感染量 (EID50/ml) 法を使用して評価し、リード・ミュンヒ法を使用して計算しました。 [21]MDCK細胞を用いたウイルス分離では、ウイルスの増殖を促進するために1 µg/ml TPCK処理トリプシンを使用した。感染細胞を5% CO2、37℃で72時間培養した。上清を採取し、さらに継代培養した。次に、RT-PCR（Qiagen、深圳）を使用して感染を検出した。H3N2ウイルス（A/canine/Shanghai/0103/2019）をカーボンパルロジオンでコーティングした銅グリッドに2分間吸着させた。余分な懸濁液をろ紙で拭き取って除去し、グリッドを直ちに1%リンタングステン酸で10分間染色した。余分な染色をろ紙で除去した後、サンプルを透過型電子顕微鏡（日立、日本）で観察した。
臨床研究とウイルス感染
ビーグル犬 16 匹 (10 週齢) を実験動物センター (Runde Biotechnology Co., Ltd.、中国上海) から入手しました。研究の前に、すべての犬から血清サンプルを採取し、動物が H3N2 CIV に曝露されていないことを確認するために、赤血球凝集抑制 (HI) アッセイにかけました。4 匹の犬を対照として使用しました。鼻腔内投与では、残りの 12 匹の犬を 3 つのグループに分け、104、105、または 106 EID50 の A/canine/Shanghai/0103/2019 を 1 ml 鼻腔内接種しました。対照群には、同量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を鼻腔内接種しました。犬は別のケージで飼育され、感染後 10 日間観察されました。
鼻腔スワブを採取し、その間に臨床症状をモニタリングした。各犬の臨床スコアは、前述のスコアリングシステムを使用して評価した。 [22]接種後10日目（感染後0～10日目（dpi））まで毎日、左右の鼻孔から鼻分泌物を採取し、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えたPBS 1 mlで希釈した。鼻腔スワブは、9～11日齢の鶏胚卵を使用してEID50値の測定に使用された。その後、対照群から2匹、各実験群から2匹の犬を感染後5日目に人道的に安楽死させた。鼻甲介、気管、および肺組織を採取し、EID50サンプル値を測定した。簡単に説明すると、採取した組織1gあたり滅菌PBS 1 mlを加え、液体窒素ホモジナイザーで粉砕した。上清を遠心分離により採取し、異なる希釈度で9日齢の鶏胚に接種した。グループの残りの2匹の犬は10日目まで観察された。
血清学的検査
血液サンプルは、2、4、6、8、10 dpi にイヌから採取されました。各イヌから約 500 µl の血清を採取し、必要になるまで -20 °C で保存しました。1 容量の血清を 3 容量の受容体破壊酵素 (RDE、Denka Seiken Co., Ltd.) と混合し、37 °C で 18 時間、その後 56 °C で 30 分間インキュベートしました。抗血清力価は HI アッセイを使用して測定しました。本研究で使用した 1% 赤血球は、SPF コックから採取し、滅菌 PBS で希釈しました。
ヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色と免疫蛍光（IF）染色を用いた組織病理学的検査
5 dpi で採取した肝臓、脾臓、肺、気管、腸の組織を 10% ホルマリンで 48 時間以上固定しました。サンプルを一晩洗浄し、アルコールで脱水し、パラフィンに包埋しました。次に、パラフィン包埋組織を 4～7 μm の厚さの切片に切り、スライドガラスに置きました。切片をマウントし、H&E 染色の前に 37 °C で一晩放置しました。
IF 染色は、脱パラフィン処理および再水和した組織切片で実施しました。簡単に説明すると、まず切片を圧力鍋で抗原アンマスキング溶液 (Vector Laboratories、カリフォルニア州、米国) で処理しました。0.1% スーダンブラック B で 15 分間、1% ウシ血清アルブミン/PBS で室温で 30 分間ブロッキングした後、膜を IAV 核タンパク質に対する一次抗体 (Abcam) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。その後、Cy5 結合ヤギ抗マウス IgG (Abcam) とともに 30 分間インキュベートし、その後切片を 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (Thermo Fisher Scientific) で染色しました。すべての切片を検査し、Carl Zeiss LSM780 共焦点顕微鏡を使用して画像を撮影しました。
統計分析
統計的有意性は、GraphPad Prism (v.7.02) ソフトウェア (GraphPad Software, Inc.、米国カリフォルニア州ラホヤ) を使用した一元配置分散分析と事後 Tukey の多重比較検定によって決定されました。P 値
1720129116
#ビーグル犬における新しいH3N2犬インフルエンザウイルス遺伝子の生物学的特徴と感染動態 #ウイルス学ジャーナル
2024-07-04 20:36:21