鳥のジャンク DNA が安全で効率的な遺伝子治療の鍵を握る可能性がある

鎌状赤血球症に対する CRISPR-Cas9 療法の最近の承認は、遺伝子編集ツールが遺伝子をノックアウトして遺伝性疾患を治療するという素晴らしい仕事をできることを実証しました。 しかし、遺伝子全体をヒトゲノムに挿入して欠陥のある遺伝子や有害な遺伝子を置き換えることはまだ不可能です。

鳥のレトロトランスポゾンを利用してゲノムに遺伝子を挿入する新しい技術は、ヒトゲノムの「安全地帯」に遺伝子を挿入するため、遺伝子治療にとってより有望である。挿入によって必須遺伝子が破壊されたり、がんが発生したりすることはない。

レトロトランスポゾンまたはレトロエレメントは、RNA に転写されると、ゲノム内の DNA に RNA をコピーして戻す酵素をコードする DNA の断片であり、ゲノムをレトロトランスポゾン DNA で混乱させる利己的なサイクルです。 ヒトゲノムの約 40% はこの「利己的な」新しい DNA で構成されていますが、ほとんどの遺伝子は無効になっており、いわゆるジャンク DNA です。

Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes（PRINT）と呼ばれるこの新しい技術は、一部のレトロトランスポゾンの能力を利用して、他のゲノム機能に影響を与えることなく遺伝子全体をゲノムに効率的に挿入します。 PRINT は、遺伝子を無効にし、点突然変異を起こし、DNA の短いセグメントを挿入する CRISPR-Cas テクノロジーの認識された能力を補完します。

カリフォルニア大学バークレー校の分子細胞生物学教授キャスリーン・コリンズの研究室で開発されたPRINTの説明が、2月20日付けのジャーナルに掲載される。 ネイチャーバイオテクノロジー。

PRINT では、ゲノム編集のために CRISPR-Cas9 を細胞に運ぶのに使用されるものと同様の送達方法を使用して、新しい DNA を細胞に挿入します。 PRINT の場合、送達される 1 つの RNA は、R2 タンパク質と呼ばれる共通のレトロエレメント タンパク質をコードします。このタンパク質には、ニッカーゼ (二本鎖 DNA に結合してニックを入れる酵素) や逆転写酵素 (二本鎖 DNA に結合してニックを入れる酵素) や逆転写酵素 (二本鎖 DNA の DNA コピーを生成する酵素) など、複数の活性部分があります。 RNA。 もう一方の RNA は、挿入される導入遺伝子 DNA の鋳型に加え、遺伝子発現制御要素、つまり R2 タンパク質がゲノムに挿入する自律的な導入遺伝子カセット全体であるとコリンズ氏は述べた。

R2 タンパク質を使用する主な利点は、同じ遺伝子の何百もの同一のコピーを含むゲノムの領域に導入遺伝子を挿入できることです。各コピーは、メッセンジャー RNA (mRNA) をタンパク質に翻訳する RNA マシンであるリボソーム RNA をコードしています。 冗長コピーが非常に多いため、挿入によって 1 つまたはいくつかのリボソーム RNA 遺伝子が破壊された場合でも、遺伝子の損失が見逃されることはありません。

導入遺伝子を安全な場所に置くことで、今日一般的な方法であるヒトウイルスベクターを介して導入遺伝子を挿入するときに遭遇する大きな問題が回避されます。遺伝子はゲノムにランダムに挿入されることが多く、機能する遺伝子を無効にしたり、遺伝子の制御や機能を混乱させたりします。 、癌につながる可能性があります。

「CRISPR-Cas9ベースのアプローチは、変異ヌクレオチドを修正したり、DNAの小さなパッチを挿入したりできる、すなわち配列固定である。あるいは、部位特異的突然変異誘発によって遺伝子機能をノックアウトすることもできる」とウォルター・アンド・ルース・シューベルト博士のコリンズ氏は語った。ファミリーチェア。

「私たちは遺伝子の機能をノックアウトしているわけではありません。内因性の遺伝子変異を修復しているわけではありません。私たちは補完的なアプローチをとっているのです。それは、活性タンパク質を作る自律的に発現する遺伝子をゲノムに組み込むことです。 」

「本当の勝者は鳥たちだった」

嚢胞性線維症や血友病などの多くの遺伝性疾患は、同じ遺伝子内の多数の異なる変異によって引き起こされ、そのすべてが遺伝子の機能を無効にします。 CRISPR-Cas9 ベースの遺伝子編集療法は、個人の特定の変異に合わせて調整する必要があります。 PRINT を使用した遺伝子補充は、病気を患っているすべての人に正しい遺伝子を届けることができ、元の変異がどのようなものであっても、各患者の体で正常なタンパク質を生成できるようになります。

多くの学術研究室やスタートアップ企業が、遺伝子治療のための遺伝子を挿入するためのトランスポゾンとレトロトランスポゾンの使用を研究しています。 バイオテクノロジー企業によって研究されている人気のあるレトロトランスポゾンの 1 つは LINE-1 (Long INterspersed Element-1) です。これはヒトではそれ自体といくつかのヒッチハイカー遺伝子を複製してゲノムの約 30% をカバーしていますが、ゲノムの LINE-1 レトロトランスポゾンは 100 未満です。現在機能しているコピーは、ゲノムのごくわずかな部分です。

コリンズ教授は、カリフォルニア大学バークレー校の博士研究員であるアカンクシャ・タワニ氏およびカリフォルニア大学バークレー校分子細胞生物学科の特別教授でハワード・ヒューズ医学研究所の研究員であるエヴァ・ノガレス氏とともに、LINE-1レトロエレメントによってコードされる酵素タンパク質の極低温電子顕微鏡構造を発表した。 12月14日の雑誌に掲載 自然。

この研究により、LINE-1 レトロトランスポゾンタンパク質を遺伝子操作して安全かつ効率的にヒトゲノムに導入遺伝子を挿入するのは難しいことが明らかになった、とコリンズ氏は述べた。 しかし、ゲノムの反復的なリボソーム RNA コード領域 (rDNA) に挿入された遺伝子が正常に発現されることを示した以前の研究は、安全な導入遺伝子挿入には R2 と呼ばれる別のレトロ要素がより効果的に機能する可能性があることを Collins に示唆しました。

R2はヒトでは見つからないため、コリンズ氏と上級研究員のXiaozhu Zhang氏および博士研究員のブリアナ・ヴァン・ツリーック氏（いずれもカリフォルニア大学バークレー校）は、昆虫からカブトガニやその他の多細胞真核生物に至るまで、多数の動物ゲノムからR2をスクリーニングして、このバージョンは、ヒトゲノムの rDNA 領域を高度にターゲットしており、その領域への長い DNA の挿入に効率的です。

「数十羽を追いかけた結果、本当の勝者はキンカチョウやノドジロスズメなどの鳥類だった」とコリンズ氏は語った。

哺乳類はゲノムにR2を持たないが、R2をレトロエレメントとして効果的に挿入するために必要な結合部位を持っている。これはおそらく、哺乳類の祖先が何らかの形で追い出されたR2のようなレトロエレメントを持っていたことの兆候であると彼女は述べた。哺乳類のゲノム。

実験では、Zhang と Van Treeck は、RNA ポリメラーゼ プロモーターによって発現される蛍光タンパク質を含む導入遺伝子を生成する、R2 タンパク質をコードする mRNA と鋳型 RNA を合成しました。 これらをヒト培養細胞に同時トランスフェクトしました。 レーザー光下での蛍光タンパク質の発現により細胞の約半数が緑色または赤色に点灯し、R2 システムが正常に機能する蛍光タンパク質をゲノムに挿入したことを示しました。

さらなる研究により、導入遺伝子が実際にゲノムのrDNA領域に挿入され、RNA鋳型の約10コピーがrDNA遺伝子のタンパク質製造活性を阻害することなく挿入できることが示された。

巨大なリボソーム生合成センター

導入遺伝子をゲノムのrDNA領域に挿入することは、導入遺伝子に安全な場所を与える以外の理由で有利です。 rDNA 領域は、5 つの別々の染色体の短いアーム上にあります。 これらのずんぐりした腕はすべて集まって核小体と呼ばれる構造を形成し、そこで DNA がリボソーム RNA に転写され、その後タンパク質を作るリボソーム機構に折り畳まれます。

核小体内では、rDNA の転写が高度に制御されており、rDNA の切断が増殖したまま放置されるとタンパク質の生産が停止する可能性があるため、遺伝子は迅速に修復されます。 その結果、ゲノムの rDNA 領域に挿入された導入遺伝子は、核小体の内部で子供用手袋で処理されることになります。

「核小体は巨大なリボソーム生合成中心です」とコリンズ氏は言う。 「しかし、それは、遺伝子挿入による発癌リスクが低い、非常に恵まれた DNA 修復環境でもあります。これらの成功したレトロ要素 (私は擬人化しています) がリボソーム DNA に取り込まれたことは素晴らしいことです。それは多コピーであり、保存されており、安全な場所です。これらのコピーの1つを破壊しても、細胞は気にしないという感覚です。」

このため、この領域はヒトの遺伝子治療のために遺伝子を挿入するのに理想的な場所となっています。

Collins 氏は、R2 がどのように機能するかについてはまだ不明な点が多く、rDNA 転写の生物学については疑問が残っていることを認めました。細胞が問題を起こす前に、どれだけの rDNA 遺伝子を破壊できるのでしょうか? 一部の細胞はヒトゲノムにある 400 以上の rDNA 遺伝子の多くをオフにするため、これらの細胞は PRINT の副作用を受けやすくなりますか?

彼女と彼女のチームは、これらの疑問を調査しているだけでなく、培養細胞やヒト組織の初代細胞で PRINT がより良く機能するように、レトロエレメントの挿入に関与するさまざまなタンパク質や RNA を微調整しています。

しかし、肝心なのは「効果がある」ということだ、と彼女は言う。 「rDNAを実際に活用するには、rDNAの生物学についてもう少し理解する必要があるだけです。」