配偶母細胞と蚊の生産
生殖母細胞培養物は、米国 BIE Resources の熱帯熱マラリア原虫 NF54 株から生成されました。 生殖母細胞培養プロトコールは、Ifediba と Vanderberg によって記載されたものから適応されました。 [11]。 簡単に説明すると、生殖母細胞の誘導は、5% ヒト血清 A+ (TCS Scientific、英国) および 5% アルブマックス (Gibco # 11021–0379）。 培養物は、毎日培地を交換し、新鮮なＲＢＣを添加せずに維持した。 成熟生殖母細胞のパーセンテージは、ギムザ染色された薄い血液塗抹標本の顕微鏡計数 (Leica、DM2000) によって評価されました。 14日目に、ステージVの生殖母細胞血症、雄と雌の生殖母細胞の比率、および雄の鞭毛除去の数について培養物をチェックした。 16日目に、ステージVの生殖母細胞血症が1〜3%、雄/雌比が1:2以上、および20中心/フィールド以上の鞭毛除去を有する培養物を蚊に給餌するために使用した。
アン。 ステフェンシー（SDA-500株） [12] コロニーは、ロンドンのインペリアル・カレッジのマイケル・デルブス氏とマーク・タニクリフ氏のご厚意により提供された卵から2014年に設立されました。 卵、幼虫および成虫は、温度 26.5 ± 1 °C、14L: 10D の日長および相対湿度 75 ± 5% の環境制御されたチャンバー (Panasonics MLR 352-H) 内で維持されました。 実験が行われる２～３日前に、蚊を小さなカップにメス４０匹／カップの密度で移した。 中腸内の蚊の細菌叢を除去するために、実験に使用した蚊の一部に抗生物質の混合物（50 mg/mL ゲンタマイシン溶液）を毎日与えました。 [Sigma-Aldrich®, G1397] およびペニシリン – ストレプトマイシン溶液 [Sigma-Aldrich®, P4333]）10％滅菌スクロース溶液中。 抗生物質による治療は、ゼロ日目から給餌の 24 時間前まで継続されました (最大連続 4 日間)。 吸血前に抗生物質ショ糖溶液を除去し、蚊を 24 時間絶食させた。 対照ケージを同じ条件で維持したが、抗生物質は使用しなかった。 抗生物質による治療を行わなかった対照蚊を同じ条件下で維持し、小さなカップに移し、吸血の24時間前に絶食させた。 抗生物質治療後の蚊は無菌状態になり、無菌蚊と呼ばれますが、未治療の蚊は敗血症と呼ばれます。
標準膜供給アッセイ (SMFA)
合計 3 つの独立した SMFA が実行されました。 SMFA ごとに、40 An のカップ。 抗生物質で処理したおよび未処理の生後 4 ～ 6 日の Stephensi 雌蚊に、ガラス製フィーダーに取り付けた Parafilm® 膜を介して、熱帯熱マラリア原虫生殖母細胞を豊富に含む血液粉を 30 ～ 40 分間給餌しました (Fisher Scientific、 #12831283) 37 °C の循環水浴に接続します。 アンの噛みつき行為以来。 ステフェンシは夜の第一四半期に高くなるため、実験で餌を与えられる蚊の割合を増やす方法として、すべての SMFA は暗闇の中で実行されました。 吸血後、敗血症蚊と無菌蚊を均等に分割し、異なる光周期相（光相（明相）と暗相（暗相））にある異なるパナソニック製保育器に移した。 光相条件のインキュベーターでは、サイクルは午前 8 時に 13.5 時間の完全な明るさで始まり、午後 9 時半から 9.5 時間の暗闇で始まり、それぞれ 0.5 時間の夜明けと夕暮れの移行を挟みました。 逆に、暗期の保育器では、サイクルは午前 8 時に 9.5 時間の暗闇で始まり、午後 6 時半から 13.5 時間の完全な明るさで始まり、それぞれ 0.5 時間の夜明けと夕暮れの移行によって区切られています。 実行されたすべての SMFA は午前 11 時から午後 12 時 30 分の間に行われました。蚊に餌を与えてから 24 時間後に、餌を与えていない蚊を数えて各カップから取り除き、各実験で餌を与えられた蚊の割合を計算することができました。
吸血後 7 日目に、実体顕微鏡を使用して蚊の中腸を解剖し、0.2% マーキュロクロム溶液で 10 分間染色しました。 個々の中腸におけるオーシストの総数を、10X対物レンズ(100X倍率)を使用する光学顕微鏡(Leica、DM2000)を使用して計数した。 感染率 (1 つ以上のオーシストを持つ蚊の割合) とオーシストの平均感染強度の両方が、テストされたすべての条件に対して定義されます。 各条件の蚊のサブサンプルは、スポロゾイトの解剖が行われる吸血後 16 日目まで維持されました。
オーシスト減少率 (OR) と伝達ブロック率 (BiT) は次のように計算されました。
(OR%=100-left(frac{{OM}_{L}*100}{{OM}_{D}}right))、ここで。
OR% = オーシストの減少率。
OML = 光期の蚊のオーシスト平均強度。
OMD = 暗期の蚊のオーシスト平均強度。
(BiT%=100-left(frac{{P}_{L}*100}{{P}_{D}}right))、ここで。
BiT% = 送信時のブロックのパーセンテージ。
PL = 光期の蚊の感染率 (感染した蚊の%)。
PD = 暗期の蚊の感染率 (感染した蚊の%)。
スポロゾイトの解剖
吸血後 16 日目から 20 日目まで、蚊を CO2 チャンバー内で 2 分間麻酔し、解剖のために氷上に保管しました。 その後、冷RPMI培地(Sigma-Aldrich®、R5886)を使用して実体顕微鏡下で唾液腺を解剖しました。 試験した同じ条件からのすべての唾液腺を、80μlのRPMI培地とともに冷1.5mlエッペンドルフチューブに一緒にプールした。 唾液腺は最長 1.5 時間かけて解剖されました。 短い回転（1000 rpm で 1 分未満）の後、サンプルを滅菌乳棒で粉砕しました。 10μlのスポロゾイト懸濁液をノイバウアーチャンバー血球計（INCYTO DHC N015、Fisher Scientific）に入れた。 対物レンズ 40 倍 (倍率 400 倍) に設定した位相差顕微鏡を使用して、スポロゾイトを数えました。 スポロゾイトの数はチャンバーの 4 つの象限で数えられ、スポロゾイトの総数は次の式を使用して計算されました。
$$frac{(4 つの ,象限)}{4}=#of ,スポロゾイト times {10}^{4}/ml$$
統計分析
データは、GraphPad Prism 6 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して分析されました。 2つの異なる日長体制における敗血症蚊と無菌蚊の間の給餌された蚊の割合、有病率、熱帯熱マラリア原虫オーシスト強度を、クラスカル・ウォリス検定とそれに続くダンの多重比較検定を使用して比較した。 マンホイットニーの U 検定を使用して、暗相と光相の間の無菌蚊のスポロゾイト数の比較が行われました。
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2024-02-08 02:53:15