この前向き研究は、2021年6月から2023年6月まで、山西省にある太原中央病院の神経内科と山西心血管脳血管病院で実施された。 この研究はヘルシンキ宣言に従って2021年に倫理委員会によって承認され（番号：2021019）、すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。
一般情報
この研究には、2018年の急性虚血性脳卒中の診断と治療に関する欧州ガイドラインに定義されている、発症から4.5時間以内の急性虚血性脳血管疾患を患う18～80歳の患者が含まれていた。 除外基準は、脳出血またはくも膜下出血、心原性脳塞栓症、血液疾患や腫瘍などによる脳卒中、肝臓、腎臓、造血系、内分泌系、変形性関節症などの重篤な合併症、精神障害または重度の認知症、脂質の使用でした。 – 過去 3 か月以内のプラーク低下薬、プラーク安定化薬、ホルモン薬、免疫抑制薬、最近の慢性または活動性感染症、および予想生存期間が 3 か月未満のその他の重篤な生命を脅かす疾患。 年齢、性別、喫煙歴、飲酒歴、高血圧歴、糖尿病歴、心房細動歴、血糖、血圧、総コレステロール、トリグリセリド（TG）、高濃度などの入院時の検査指標を含む患者情報が収集されました。リポタンパク質 (HDL) コレステロール、低密度リポタンパク質 (LDL) コレステロール、ホモシステイン (HCY)、およびミエロペルオキシダーゼ (MPO)。 さらに、患者は脳卒中発症時間に基づいて 4 つのサブグループに分類されました。サブグループ 1 (0:00 ～ 05:59)。 サブグループ 2 (06:00–11:59); サブグループ 3 (12:00–17:59); サブグループ 4 (18:00 ～ 23:59)。 すべてのサブグループの採血時間は、指定された制限時間内でした。
交絡因子を制御するために、対照群は、年齢および性別の点で研究群と一致する末梢前庭性めまい症または頸椎症を患う個人で構成されました。 対照群には虚血性脳卒中やその他の神経変性疾患の症状や病歴がなく、研究群と同じ時点で同じ検出方法を使用して検査されました。 さらに、登録されたすべての患者には、これまでに睡眠障害や最近の異なるタイムゾーンを越えた旅行の記録はありませんでした。
NIHSSスコア
入院時の研究グループの神経学的欠陥スコアは、国立衛生研究所脳卒中スケール (NIHSS) を使用して評価され、その使用について訓練を受けた 2 人の熟練した専門家によってスコアが評価されました。
マロンジアルデヒド (MDA) やスーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) などの酸化ストレス因子、インターロイキン 6 (IL-6) や腫瘍壊死因子 α (TNF-α) などの炎症因子、SIRT1、BMAL1 の検出。
この研究では、臨床介入の前に、まず参加者全員から末梢静脈血 5 mL を EDTA 抗凝固チューブに採取しました。 単核球は、1 容量の新鮮な全血を 3 容量の赤血球ライセートに添加し、続いて 450 × g で 10 分間 4 °C で遠心分離して白血球をペレットにするプロトコールを使用して、超清浄な作業台の下で 1 時間以内に単離されました。 ２倍量の赤血球溶解物を加え、混合物を再度遠心分離して白血球ペレットを得た。 上清を廃棄した後、単離された細胞を 1.5 mL EP チューブに入れ、ELISA およびウェスタンブロット検出が実行されるまで -80 °C で保存しました。
酸化ストレス因子（MDAやSODなど）や炎症因子（IL-6やTNF-αなど）の発現レベルをELISAで測定しました。
サンプル中のMDA、SOD、IL-6、TNF-α含量は、ヒトMDA ELISAキット、ヒトSOD ELISAキット、ヒトIL-6 ELISAキット、ヒトTNF-α ELISAキットを用いて競合法により分析した。 抗体でプレコートされた酵素標識ウェルにサンプルを加えました。 次に、ビオチン標識認識抗原を添加し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。 抗原と固相抗体は結合をめぐって競合し、免疫複合体を形成します。 PBSTで洗浄して未結合のビオチン抗原を除去した後、アビジン-HRPを添加し、37℃で30分間インキュベートしました。 アビジン-HRPがビオチン抗原と完全に結合したら、洗浄し、発色溶液AおよびBを加えました。 混合物を 37 °C で 10 分間インキュベートして、色を発色させました。 最後に、停止液を加えて反応を停止させた。 OD 値は 10 分以内に読み取られ、計算されました。23。
SIRT1 および BMAL1 の発現レベルを検出するためのウェスタンブロット
単離した単球を液体窒素でホモジナイズした後、1 mlのPBSを加え、500×gで5分間遠心分離しました。 次に細胞を最大出力 (3 × 10 秒) で氷浴に短時間置き、得られた上清を 12,000 rpm、4 °C で 15 分間の遠心分離によって収集しました。 タンパク質濃度はBCAタンパク質定量法を使用して決定し、後で使用するために-20℃で保存しました。 SDS‒PAGE ゲル電気泳動を実行し、得られたタンパク質バンドをトランスファー電気泳動によって PVDF メンブレンに転写しました。 室温で 1 時間メンブレンをブロッキングした後、一次抗体のインキュベーションを 4 °C で一晩実施しました。 続いてメンブレンを 1 × TBST で洗浄し、二次抗体とともに 60 分間インキュベートしました。 メンブレンを洗浄して遊離の二次抗体を除去した後、ECL キットを使用して結果を視覚化しました。 膜は化学発光イメージング システムを使用して画像化されました。 WB ストリップのグレー値は、ImageJ ソフトウェアを使用して分析されます。
統計分析
データは、SPSS 25.0 および R 4.2.0 統計ソフトウェアを使用して分析されました。 Graph Pad Prism 8.0 ソフトウェアをグラフ作成に使用し、Image J2x ソフトウェアをすべてのウェスタン ブロット バンドのグレー値の分析に使用しました。 正規性検定を行った後、正規分布に従う測定データを「X−(平均)±S(SD)」で表した。 2 つの独立したサンプルの t 検定により、2 つのグループ間の平均値が比較されました。 歪んだ分布データは M(P25, P75) で表され、z 検定を使用して比較されました。 複数のグループ間の比較には一元配置分散分析を使用し、均一性分散検定を実行しました。 カウントデータは頻度とパーセンテージ (n、%) として表され、χ2 検定を使用して分析されました。 BMAL1、SIRT1、IL-6、TNF-α、MDA、およびSODの間の相関分析は、ピアソン相関分析によって実行されました。 検定レベルは両側 α = 0.05 で、P < 0.05 が統計的に有意であると見なされました。 ウエスタンブロットストリップは、グレー値分析用のImageJ 2×ソフトウェアによって分析されました。
倫理的承認
この研究は太原中央病院の医倫理委員会によって承認されています（承認番号：2021019）。 私たちは、この研究が 1964 年のヘルシンキ宣言とその後の改訂の原則に厳密に従っていることを保証します。 研究プロセス全体を通じて、私たちは医療倫理原則に従い、関連する国内法および規制を積極的に遵守してきました。 私たちは参加者の自主性を尊重し、善意、非悪意、正義の原則を遵守します。 このプロジェクトは倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って実施されており、参加者またはその権限のある代表者からインフォームドコンセントが得られています。 参加者の権利と安全を効果的に保護するために、インフォームド・コンセントのための包括的な手順が導入されています。
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#虚血性脳卒中発症の初期における酸化ストレスの調節におけるSIRT1BMAL1経路の役割
2024-01-20 06:35:09