薬剤と主剤
薬剤: 第 Xa 因子の経口直接阻害剤である RIVA は、ChemBest Research Laboratories Ltd. (CAS No. 366789-02-8) から購入しました。
生化学試薬: アラニンアミノトランスフェラーゼ (ALT) キット (カタログ番号 C009-1) およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST) キット (カタログ番号 C010-1) は、Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering から購入しました。 ヒドロキシプロリン標準品 (トランス-4-ヒドロキシ-L-プロリン、カタログ番号 H54409) は Sigma から購入しました。
抗体および病理検査試薬：SABC免疫組織化学染色キット（カタログ番号：SA1028-ウサギIgG）、抗PAI-1抗体（カタログ番号：ab66705）、抗フィブリノーゲンウサギモノクローナル抗体（カタログ番号：ab189490）、抗von Willebrand 因子 (vWF) 抗体 (カタログ番号 ab6994) はすべて Sigma から購入しました。
ラットにおける肝硬変のPVTモデルの確立
体重 160 ～ 180 g の雄の Sprague-Dawley ラット 56 匹を北京バイタルリバー研究所動物技術有限公司から入手しました。そのうち 7 匹のラットを正常対照として使用し、他の 49 匹のラットには PPVL 手術を受けました。[[11］、1週間後、図のフローチャートに示すように、生存ラットにCCl4を4〜10週間腹腔内注射しました。 1B. 簡単に言うと、ラットの皮膚を消毒しました (図 2)。 1-A1)、上腹部に 1.5 ～ 2 cm の縦切開を加えます (図 1)。 1-A2)。 主要な門脈を露出させて分離した後、20G 針を門脈に隣接して配置し、その後門脈を絹糸で結紮しました（図 1）。 1-A3)。 このとき、小腸と停滞していた腸間膜静脈は安定し、これらの静脈の色は紺色または紫色に変わりました（図1）。 1-A4)。 その後、針をゆっくりと抜くと、門脈の血流が部分的に回復しました。 ペニシリンを腹腔内に注射した後（図） 1-A5)、腹膜と皮膚を別々に閉じました (図 1)。 1-A6)。 1週間後、図に示すように、PPVLを投与されたラットに、異なる用量のCCl4を10週間腹腔内注射しました。 1B.
実験計画
PPVL の 1 週間後の生存ラットは、乱数表に従ってランダムに 6 つのグループに分けられました: PPVL 対照グループ (CCl4 中毒なし; n = 6)、4 週間モデル グループ (n = 6)、6 週間モデル グループ(n = 6)、8 週間モデル グループ (n = 6)、10 週間モデル グループ (n = 10)、および RIVA 治療グループ (n = 10)。 モデルグループのすべてのラットに、オリーブオイルに溶解した25〜40％CCl4を週に2回、4週間から10週間腹腔内注射しました。RIVA処置グループのラットは、10週間のCCl4中毒を受け、RIVA（20mg/kg）を経口摂取しました。体重[[[[9』）を第4週末から第10週末までの6週間開催します。 一方、同じ種と体重を持つ 7 匹のラットは、正常な対照群と同じ量の生理食塩水を摂取しました (n = 7)。 すべての動物実験は、中国上海市の上海中医薬大学実験動物センターの施設内動物倫理委員会によって承認されました（倫理番号：SZY201804011）。 ラットの安楽死は、ペントバルビタール ナトリウムをラット体重 1 kg あたり 150 ～ 200 mg 腹腔内投与することで行われ、これは動物の民族に関する大学のガイドラインに準拠していました。
ラットにおける肝硬変を伴う門脈血栓症の動物モデルは、部分門脈結紮術 (PPVL) と CCl4 中毒によって確立されました。 (A) PPVL の外科的手順: (A1) 皮膚の準備と消毒。 (A2) 腹部の正中線に沿って約 1.5 ～ 2 cm の縦切開を行います。 (A3) 20G 針を門脈上に隣接して配置しました。 (A4) 絹糸を用いて門脈を 20G 針で結紮し、ゆっくりと針を引き抜いた。 (A5) ペニシリンを注射しました。 (A6) 腹部と皮膚を閉じた。 (B) モデル構築のフローチャート。 まず、160 ～ 180 g のラットに PPVL 手術を受けさせました。 1 週間後、ラットに 25 ～ 40% CCl4 を 2 ml/kg 体重の量で週 2 回腹腔内注射し、以下の時点に従って異なるモデル グループに分けました: 4 週間 (n = 6)、6 週間週 (n = 6)、8 週 (n = 6)、および 10 週 (n = 10)
生化学検査
腹腔を開いた後、腹部大動脈から血液を採取した。 ラットから血清を収集し、キットを使用してALTおよびASTレベルをアッセイしました。 さらに、抗凝固剤で治療した各ラットから 4 ml の血漿を採取し、2 本のチューブに等分し、曙光検査センターによる血小板 (PLT)、フィブリノーゲン (FIB)、D-ダイマー、および AT III の検出に適用しました。上海中医薬大学付属病院。
肝hyp含有量アッセイ
組織内のヒドロキシプロリン (Hyp) 含有量は Jamall の方法で測定されました[[[[12]。 簡単に説明すると、肝臓サンプル 100 mg をホモジナイズし、12 M HCl 中で 110 °C で 18 時間加水分解しました。 加水分解物の濾過後、クロラミン T を最終濃度 2.5 mM になるまで室温で 10 分間加えました。 次いで、混合物をイソプロパノール中の25% (w/v) p-ジメチルアミノベンズアルデヒドおよび27.3% (v/v) 過塩素酸で処理し、50℃で90分間インキュベートした。 最後に、サンプルを試薬ブランクに対して 558 nm で検査しました。 各サンプル中の Hyp の濃度は、0.2 ～ 1.6 μg の範囲の一連の既知量の Hyp (ペプチド社、日本) から作成された標準曲線から決定されました。 Hyp 濃度は、μg/肝臓重量 g として表されます。
組織学的検査
採取した肝臓組織を 4% ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋しました。 切片 (4 μm) をヘマトキシリン エオシン (HE) およびシリウス レッドで染色しました。
免疫組織化学
パラフィン包埋切片 (4 μm) を免疫組織化学染色に供しました。 内因性ペルオキシダーゼ活性は、3% H2O2 を含むメタノールおよびウシ血清アルブミン (BSA) によってブロックされました。 PBS で洗浄した後、切片を以下の一次抗体、抗フィブリノーゲン抗体 (ab189490、1:1500) および抗 PAI1 抗体 (ab66705、1:200) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 2日目に、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体とともに37℃で1時間インキュベートしました。 ジアミノベンジジン (DAB) を色原体として使用し、続いてヘマトキシリン対比染色を行いました。
免疫蛍光
収集した肝臓組織を Tissue-Tek OCT 包埋培地に入れ、液体窒素中で急速冷凍しました。 次に、組織をアセトンで 10 分間固定し、PBS で洗浄し、0.5% BSA で 37 °C で 1 時間ブロックしました。 組織を一次抗体抗 vWF (ab6994、1:200) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、フルオレセインイソチオシアネート標識二次抗体をサンプルに添加し、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 続いて、DAPI (ab228549、1:1000) を使用して核を染色しました。 組織は、画像化のために共焦点顕微鏡下で観察された。
ウェスタンブロット分析
肝臓溶解物を 10% SDS‒PAGE ゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。 メンブレンを 5% BSA でブロックし、さまざまな一次抗体: 抗フィブリノーゲン抗体 (ab92572、1:1000) または抗 PAI-1 抗体 (ab66705、1:1000) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 PBSで3回洗浄した後、膜を二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。 さらに 3 回洗浄した後、Li-Cor odyssey で膜をスキャンして画像化しました。
門脈超音波検出
経験豊富な B モード超音波医師がドップラー超音波 (フィリップス IU22) を適用し、動物用の特別なプローブを使用してラットの門脈血栓症、門脈血流速度、門脈直径を観察しました。 超音波周波数は 11 M に設定され、血流角度は < 60°でした。
統計分析
すべてのデータは、SPSS ソフトウェア バージョン 26.0 を使用して分析されました。 グループ間の差異は、ノンパラメトリック一元配置分散分析 (ANOVA) とその後の最小有意差 (LSD) 事後検定によって評価されました。 定量的データは、平均値±標準偏差 (SD) として表されます。 AP 値 < 0.05 は統計的有意性を示すとみなされました。
1715612229
#肝硬変ラットにおける門脈血栓症の新しいモデル門脈部分結紮と四塩化炭素により誘導されリバーロキサバンが介入した #BMC消化器科
2024-05-13 14:41:28