ニューヨーク州アプトン—米国エネルギー省（DOE）ブルックヘブン国立研究所とコロンビア大学の科学者チームは、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の原因ウイルスであるSARS-CoV-2が結合する受容体を大量に生成する方法を実証した。人間の細胞の表面にあります。 今や悪名高いウイルススパイクタンパク質とヒトの「ACE2」受容体との結合は、ウイルスによる感染の最初のステップである。 機能的なヒトACE2タンパク質をマウス細胞内で作製することにより、科学者はこれらの受容体を研究し、それらを利用できる新たな方法が得られる。 さらに、ジャーナル Virology に掲載されたばかりの論文で説明されているように、この方法は、他の方法では生成することが難しいことが証明されている他の複雑なタンパク質の研究を容易にする可能性があります。
ブルックヘブンの科学者らのパンデミック初期の当初の目標は、大量のヒトACE2を生成し、そのタンパク質をナノ粒子に結合させることであった。 ACE2 でコーティングされたナノ粒子は、抗ウイルス治療薬として、および/またはウイルス粒子を検出するセンサーとしてテストできる可能性があります。
「これらの用途のいずれにも、大量のタンパク質が必要であり、そのタンパク質は完全に機能する必要がある」とブルックヘブン研究所のウイルス学者は述べた。 ポール・フライマスブルックヘブン研究所の科学者と協力して研究を主導したのは 機能性ナノ材料研究センター (CFN)。 「しかし、タンパク質が細胞膜に局在するプロセスは複雑であるため、ACE2のような機能的な膜タンパク質を作製することは特に困難です。」
その理由の 1 つは、これらのタンパク質が合成後、細胞膜に挿入される前にさまざまな方法で修飾されることです。 特に、タンパク質に付加された炭水化物分子は、長いタンパク質鎖がどのように最終的な 3D 構造に折り畳まれるのか、またタンパク質が膜内でどのように機能するのかの両方において重要な役割を果たします。
「炭水化物はACE2タンパク質の質量の約3分の1を占めます」とFreimuth氏は述べた。
科学者が人工的にタンパク質を生成するために使用する最も単純な細胞、つまり細菌には、炭水化物を付加するための酵素がありません。 そこでブルックヘブンのチームは、哺乳類としては私たちに似ており、同じ種類の炭水化物の処理ができるマウスの細胞に注目した。 マウス細胞は、「外来」遺伝子を見つけて発現させることに熟達していることが知られています。 また、マウス細胞も ACE2 受容体を生成しますが、マウス版のタンパク質は SARS-CoV-2 スパイクに結合しません。 つまり、科学者らは、スパイクが細胞に結合するかどうかを確認することで、マウスの細胞がヒトのACE2タンパク質を生成しているかどうかを簡単に確認できることになる。
ACE2遺伝子の発見と発現
マウス細胞がヒトACE2遺伝子を正しく取り込んで読み取る可能性を高めるために、研究グループは無傷の遺伝子を使用した。 人間やその他の「高等生物」の遺伝子には、タンパク質を構成するアミノ酸の構成要素をコードする DNA 配列に加えて、多くの情報が含まれています。 この追加情報は、細胞の染色体内で遺伝子の構造と機能を制御するのに役立ちます。
科学者たちは、研究の一環として生成されたクローン化された DNA 断片のライブラリを検索しました。 ヒトゲノムプロジェクトこれは、私たち人間を構成するすべての遺伝子の位置を地図上に明らかにするDOEの後援による取り組みで、完全な制御情報が埋め込まれた完全なACE2遺伝子を含む断片を見つけることを目的としています。 次に、この DNA 断片と致死性の抗生物質に対して細胞を耐性にする別のタンパク質の遺伝子でコーティングされたナノ粒子にマウス細胞を曝露しました。
「この場合、ナノ粒子は細胞に取り込まれるDNA送達剤として機能するため、DNAはマウス細胞の染色体に組み込まれる可能性がある」とフライマス氏は述べた。 「外来遺伝子を取り込んだ細胞を見つけるために、細胞培養に抗生物質を加えます。抗生物質耐性遺伝子を取り込んで発現できなかった細胞は死滅しますが、抗生物質耐性を獲得した細胞は生き残り、コロニーを形成します」 。」
科学者らは、これらのコロニーのうち約 50 個を個別に培養し、どれだけのコロニーがヒト ACE2 遺伝子を取り込み、ヒト受容体タンパク質を産生したかを調べた。
タンパク質生成の検出
「抗生物質耐性コロニーの約70％が細胞表面にヒトACE2タンパク質を発現していた」とフライマス氏は述べた。 「さらなる分析により、これらのコロニーには平均して 28 コピーのヒト ACE2 遺伝子が含まれていることが判明しました。」
重要なのは、マウス細胞が「外来」ACE2遺伝子のコピーを保持し、これらの遺伝子によってコードされるヒトACE2タンパク質を少なくとも90細胞世代にわたって作り続けたことである。
細胞によって産生されるヒト ACE2 タンパク質のレベルは、一般に、マウスのゲノムに組み込まれた ACE2 遺伝子のコピー数に比例しました。 マウス細胞クローンのいくつかは、マウス細胞に通常存在する量の約 50 倍の ACE2 を産生しました。
研究者らはさまざまな方法を用いて、マウスで作ったヒトのACE2タンパク質が機能するかどうかをテストした。 これらには、新型コロナウイルススパイクタンパク質を含む「偽ウイルス」、つまりSARS-CoV-2の非病原性代替ウイルスが受容体に結合して細胞に感染する可能性があることを実証することが含まれていた。
「これらの感染力アッセイは、これらのマウス細胞上で発現されたヒトACE2タンパク質が完全に機能することを示した」とフライマス氏は述べた。
用途と影響
その間、 オレグ・ギャング そして フェイユエ・テンCFNの研究共著者らは、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の潜在的な治療法として、おとりのヒトACE2が豊富に含まれる細胞外ナノ小胞を作製するさまざまな方法を探索した。 彼らはまた、感染症治療やウイルスの迅速検出における潜在的な応用のために、ナノ粒子上にACE2タンパク質を配置することも研究している。
「ACE2ベースのナノ小胞によってもたらされる課題は、SARS-CoV-2に対する中和効果を高めることにあります。また、ACE2結合ナノ粒子の結合感度と特異性を強化して活用し、ウイルスに有用にする方法も模索しています」どちらのアプローチも今後の最適化の取り組みが必要になるだろう」と、この研究の生物学的側面と潜在的なナノサイエンスベースの応用の両方に幅広く取り組んだCFNの研究員テン氏は述べた。
「私たちは、新しい治療戦略やセンシング戦略を開発するために、ナノ材料製造の進歩と生体分子アプローチを組み合わせることに興奮しています」とコロンビア大学で兼務しているギャング氏は述べた。 「ナノマテリアルとバイオシステムではまったく異なる特性評価アプローチが必要であったため、この研究によりいくつかの方法論的問題を克服することができました。ここで学んだことは、ナノ粒子ベースのバイオセンシングを強化する次のステップにとって重要です。」
この研究は、組換え ACE2 タンパク質の応用可能性を可能にすることに加えて、広範囲の複雑なタンパク質を生成するための新しいアプローチも実証しています。 例としては、数え切れないほどの生物学的プロセスや疾患プロセスを媒介する膨大な数の細胞表面受容体や、モノクローナル抗体や酵素などの産業上重要なタンパク質が挙げられます。
「細菌の増殖に使用される液体ブロス培養と同様に、巨大な浮遊培養での増殖に適応できるマウス細胞とともに無傷の遺伝子を使用する我々の方法は、これらおよび他の重要なタンパク質の大規模生産を前進させる可能性がある」とフライマス氏は述べた。 。
この研究は、研究所主導型研究開発助成金によって支援され、ブルックヘブン国立研究所の機能性ナノマテリアルセンター (CFN) のリソースを使用しました。 CFN は、DOE 科学局 (BES) が支援する DOE 科学局のユーザー施設です。
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#科学者がマウス細胞で新型コロナウイルス受容体タンパク質を生成
2024-01-22 10:02:00