からのサルベコウイルスの分離 R. cornntns
表2からのコロナウイルスの分離 R. cornntns図2
コウモリの経口スワブサンプルからのサルベコウイルスの分離。 3 DPIでCOV/BAT54を接種したVero-RCACE2細胞におけるSyncytium形成。スケールバー：100μm
日本南部で循環するサルベコウイルスの遺伝的多様性
私たちのBAT由来のサルベコウイルスカゴシマ分離株の遺伝子分析により、2022年2月14日に分離された4つのウイルス（COV/BAT54、COV/BAT70、COV/BAT72、およびCOV/BAT74）がほぼ同一であり、99.83％ヌクレオチドの同一性を共有したことがほぼ同一であることが明らかになりました。他の4つの分離株に対する97.43–97.53％ヌクレオチド配列同一性（表3）。 2022年10月27日に収集されたCOV/BAT306は、より長い遺伝的距離を示し、他のカゴシマ分離株と97.49–97.64％のヌクレオチド配列同一性を示しました（表3）。
2025年2月25日にBAT由来のサルベコウイルスクマモト分離株の遺伝子分析により、3つのウイルスすべて（COV/BAT25-5、COV/BAT25-27、およびCOV/BAT25-44）の間で大きなばらつきが明らかになり、96.4〜97.36％の核小片の同一性を共有しています（表3）。さらに、2025年からのクマモト分離株は、2022年のkagoshima分離株からの遺伝的差異を示し、ヌクレオチド配列のアイデンティティは95.98〜98.32％の範囲です（表3）。これらの発見は、遺伝的に多様なサルベコウイルスが個別に循環していることを示しています。 R. cornntns 日本南部の人口。
私たちの分離株は、RC-MK2に対して最も高いヌクレオチド配列同一性（92.25–93.59％ヌクレオチド同一性）を示し、 R. cornntns 2020年に日本東部のチバ県で、Genbankに登録されたサルベコウイルスの中で [7] （表3）。 COV/BAT25-27およびCOV/BAT25-44を除くすべての分離株は、完全なオープンリーディングフレームを含む大きな削除のためにORF8遺伝子領域全体を欠いていました。完全なORF8遺伝子欠失がRC-MK2で報告されています [7]。
系統解析により、私たちの分離株は、から分離されたサルベコウイルスとは別の明確なクラスターを形成したことが明らかになりました。 R. cornntns RC-MK2などの東部の日本では（図3） [7]。これらの結果は、日本南部で循環するBAT由来のサルベコウイルスは、BAT集団の生態学的ダイナミクスの地域の違いを反映している可能性が高い日本東部のサルベコウイルスとは異なることを示唆しています。
表3分離株間のフルゲノームヌクレオチド同一性図3
由来の遺伝子の系統解析 ベタコロナウイルス。系統解析は、ベタコロナウイルスの完全なゲノムのヌクレオチド配列に基づいて実施されました。私たちの分離株は黒い円で示されています。日本東部からの分離株は、黒い三角形で示されています。系統樹は、1,000の複製のブートストラップ分析で構築されました。 > 70％のブートストラップ値がノードに表示されます。スケールバーは、サイトごとのヌクレオチドまたはアミノ酸置換の数を示しています
Sタンパク質のRBDのアミノ酸配列から推測される限られたHACE2使用量
サルベコウイルスSタンパク質のRBDは3つの領域に分割でき、HACE2への結合に関与するアミノ酸残基が同定されています [14]。 RBDのアミノ酸配列に基づいて、我々の分離株は、侵入受容体としてHACE2を利用できない他のBAT由来のサルベコウイルスと一致する領域2で9〜11アミノ酸の欠失を示しました（図4）。 COV/BAT82、COV/BAT25-5、およびCOV/BAT25-27は、領域1の位置447（G447）でグリシンの欠失を示しました。これらの発見は、HACE2を結合する分離株の限られた能力を示唆しています。
図4
Sタンパク質におけるRBDのアミノ酸配列の整列。 SarbecovirusesのSタンパク質におけるRBDのアミノ酸配列は、HACE2を使用できます。 [8]。 SARS-COV-2およびSARS-COVのHACE2に接触するRBDのアミノ酸残基は、黒い円によって上側に示されています
BAT由来のサルベコウイルスのRCACE2依存性複製
1.0のMOIで分離株をVero、vero6/tmprss2、およびvero-rcace2細胞に接種し、rcace2への依存性をBAT由来のサルベコウイルスの侵入受容体として調査しました。 1週間後、CPEはVero-RCACE2細胞でのみ観察され、分離株がRCACE2発現の非存在下で感染または複製できないことを示しています。
私たちは、最大72 HPIの複数の時点で分離株に感染したVero-RCACE2細胞から上清を収集し、ウイルス複製に対する分離株間の遺伝的変異の影響を評価するためにウイルス力価を測定することにより、成長速度論を評価しました。ウイルスは12 HPI以内で検出可能で、48 HPIの前にピーク価が観察されました（図5）。したがって、私たちの分離株間の遺伝的変異は、RCACE2発現細胞の成長速度に最小限の影響を及ぼします。
図5
Vero-RCACE2細胞のウイルス成長速度。私たちの分離株は、Vero-RCACE2細胞に接種されました。ウイルス力価は、TCID50アッセイによってVero-RCACE2細胞のいくつかの時点で決定されました。点線は、検出限界を示します
シリアのハムスターを使用した動物実験
シリアのハムスターは、一般的にSARS-COV-2感染を研究するために使用されます [22, 23]。私たちは、分離株の異種間の可能性を評価するために、代表的な株であるCOV/BAT54を伴うシリアのハムスター内に接種しました。肯定的なコントロールとして、ハムスターの別のグループにSARS-COV-2を接種しました。 SARS-COV-2に感染したハムスターの体重は減少しましたが、COV/BAT54を接種したものは臨床徴候または有意な体重減少を示しませんでした（図6A）。 14 dpiで収集された血清サンプルは、ELISAおよびマイクロニュートラン化アッセイを使用して分析し、ハムスターのCOV/BAT54感染を確認しました。株特異的抗体は、SARS-COV-2接種ハムスターで検出されましたが、COV/BAT54にさらされたものでは検出されませんでした（図6BおよびC）。接種後14日で中和抗体がないことは、COV/BAT54がシリアのハムスターに感染を確立しなかったことを強く示唆しています。一般に、免疫適格宿主のウイルス複製は、適応免疫系の活性化とウイルス特異的抗体の産生をもたらします。これらの発見は、シリアのハムスターがCOV/BAT54の影響を受けないことを示しており、異種間の伝播の可能性が限られていることを示唆しています。さらに、これらの結果は、分離株が排他的に循環していることを意味します R. cornntns、ウイルス複製のRCACE2発現への強い依存性を示すin vitro所見と一致しています（図5）。
図6
シリアのハムスターを使用した実験的感染。シリアのハムスターには、COV/BAT54、SARS-COV-2、またはPBS（MOCK）のいずれかを鼻腔内接種し、14 DPIまでの臨床徴候と体重の変化について毎日監視されました（a）。 14 dpiでは、動物を安楽死させ、微量化のために血清サンプルを収集しました（b）そしてエリサ（c）アッセイ。点線は、アッセイ検出限界を表します
#日本南部の微生物から分離されたサルベコウイルスの遺伝的多様性 #Virology #Journal