重量170〜200 g、2.5〜3.0か月のWistarラット（女性）が使用されました。この研究は、実験動物の維持と取り扱いのための基本的な要件と、研究やその他の科学目的で使用される脊椎動物の保護のための欧州条約の規定に準拠して実施されました（Strasbourg、1986）。実験動物を含むすべての手順は、動物と協力する倫理原則に準拠したウクライナのNASである実験病理学、腫瘍学、放射線生物学研究所の生命倫理委員会によってレビューおよび承認されました。すべての動物実験は、到着ガイドラインと推奨事項（研究デザイン、サンプルサイズ、包含および除外基準、ランダム化、盲検化分析、結果評価、および統計的方法）に従って実行されました。
細胞培養とウイルス： 不死化ブル腎細胞（MDBK系統）、および小胞口内炎ウイルス（VSV）（インディアナ株）。細胞株とウイルス株は、Re Kavetsky Ieporのヒトおよび動物組織（2001年12月19日のウクライナ決議第1709号閣僚の閣僚、2009年2月19日の全米科学アカデミー登録証明書登録証明書登録証明書）からの細胞株の銀行から得られました。
試薬： 高グルコースDMEM（Biowest、France、Cat。No。L0102-500）、新生児子牛血清（NCS）（Biowest、France、Cat。No。S0750-500）、Versen’s Solution（Vetline Agroscience、Ukraine、シリーズ1）、生理学的ソリューション（Lekhim、gentine、シリーズ71,033,007） （Sigma、USA、Cat。No。G1397）、Crystal Violet（Sigma、USA、Cat。No。C6158）、およびTrypan Blue（Applichem、Germany、Cat。A0668）を使用しました。
in vitroの敏感な細胞系で研究されたサンプルの抗ウイルス活性を決定するために、1999年の国際標準WHO国際標準はインターフェロンα標準として使用されました。インターフェロンα2bヒト、rDNA 大腸菌 導出された95/566、70,000 IUあたりAmpoule。
勉強薬： ヒト組換えインターフェロン-α2B（IFN）薬物、鼻形態：
No.1。Interferon-α2B鼻スプレー（Nazoferon）（JSC Farmak） – 以下、「スプレー」、IFN 100,000 IU/mLの初期濃度と呼ばれます。
No.2。Interferon-α2B鼻スプレー（ゲルの形で）（JSC Farmak） – 以下、「ゲル」と呼ばれる、IFN 100,000 iu/mlの初期濃度。
インターフェロンα -2bの「スプレー」および「ゲル」および薬物投与後の実験動物の鼻腔（WNC）からの洗浄の鼻腔内投与
in vivo系でIFN鼻準備「スプレー」および「ゲル」の特定（抗ウイルス性）活性の期間を決定するために、薬物は、元の薬物の総量100μlの総体積100μlの実験動物に（鼻腔内）実験動物に投与されました：それぞれの結節中の50μlの50μL。 この薬は一度投与され、その後、実験動物におけるWNCのいくつかの手順を、スケジュールされた時間間隔（1、3、4時間）で自動ピペットを介して実施しました。各動物の鼻腔は、300μL/動物の体積で滅菌生理学的溶液で洗浄されました。この研究では、39のWistarラット（女性）が使用されました。この研究は、9つのグループの動物グループの参加で実施されました：6つの実験グループと3つの対照群。実験のスキーム（動物のグループとその数）を以下に示します（表1）。
表1監視設計
テストスプレーとゲルは、2〜8ºCの温度で光から保護された場所に保存されます。ボトルを開いた後、薬は冷蔵庫に保管されているときに10日間安定性と活動を保持します（2〜8°C）。投与前に薬を室温に温めました。
の評価 in vitro 鼻IFNの投与後のラットのWNCの抗ウイルス効果
細胞の栽培。 MDBK細胞は、5％CO2および37°Cの加湿雰囲気の細胞培養用のプラスチック皿に10％NCSと40μg/mLゲンタマイシンを添加した完全な栄養培地（DMEM）で培養しました。培地が変更され、細胞は標準的な方法に従って再播種されました [8]。細胞は、Versenの溶液を介して単層の80〜90％のコンフルエンスに達した後、培養されました。実験では、成長の指数関数的段階にあった細胞を使用しました。
ウイルス。 小胞口内炎ウイルスインディアナ株は、ラブドヴィリダ科のウイルスです。
ウイルスは牛に感染し、人間に感染する可能性があり、インフルエンザのような症状や脳炎の病気を引き起こします。ベシクロウイルスは比較的単純で、わずか5つのタンパク質から作られた弾丸型ビリオンに包まれた線形、単一の鎖、負の感覚RNAゲノムを持っています。培養細胞に感染すると、ウイルス産物は細胞遺伝子の発現をオフにし、細胞の代謝能力全体を押収します。彼らはまた、細胞骨格を解重合して急速な組織破壊を引き起こす [9]。 VSVは、標準的な方法に従ってVeroセルで開発されました [10] 液体窒素に保存されています。 MDBKセル上のVSVの力価は5×108 PFU/mLでした。
WNCの抗ウイルス活性の評価 経由 敏感な細胞試験システム。 テストサンプル（WNC）におけるIFN-αの濃度は、MDBK細胞を使用し、VSVをテストシステムとして使用した標準的なマイクロメートドを使用した抗ウイルス活性によって決定されました。 IFN MDBK細胞の抗ウイルス活性を決定するために、5％NCSと40μg/mLゲンタマイシンを備えた完全なDMEMで2×104細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに播種し、37°Cおよび5％CO2でインキュベートしました。 24時間後、テストサンプルとヒトIFN-α標準を対応するウェルに導入し、細胞を37°Cで5％CO2の存在下でさらに24時間インキュベートしました。 1日後、2％NCを持つDMEMで、対照細胞を除くすべてのウェルにVSVをすべてのウェルに加え、細胞を37°Cおよび5％CO2でインキュベートしました。 24時間後、得られた結果を視覚的に（直接顕微鏡法）登録し（直接顕微鏡法）、細胞をクリスタルバイオレットで染色することにより比色的に登録しました。活動の単位は、薬物の最後の希釈の逆と見なされ、VSVの細胞障害効果から細胞の50％を保護しました。 IFN-αの濃度は、液体（IU/mL）あたりの国際単位で発現しました。
結果を評価するための比色法。 インキュベーションの終了後、ライブ細胞をクリスタルバイオレットで染色しました。栄養培地をプレートから除去し、50μlの結晶バイオレット溶液（1 mlの70％メチルアルコール中の5 mg色素）を各ウェルに加えました。 10分後、染料を流水で3回洗浄しました。その後、プレートを室温で乾燥させ、染料を300 rpmのPSU-2 Tミニシェーカーを使用して、96％エチルアルコール（100μL/ウェル）で10分間溶出しました。結果は、波長540 nmの垂直ビーム経路を持つ分光光度計を介して記録されました。プレートの各井戸の生細胞の数（x）は、次の式を介してパーセンテージとして計算されました：（x = frac {{a_ {1} cdot 100 ％}} {{a_ {0}}} ）、a0はa0がopt式密度の光密度の光密度の平均値です。実験グループ。
統計分析。 調査されたインジケーターの平均値（m）と算術平均（m）の平均誤差の計算は、Excel 2016ソフトウェアパッケージを介して実行されました。ノンパラメトリックMann -Whitney Uテストを使用して、グループ間の研究された指標の違いの統計的有意性のレベルを評価しました。 Statistica 6.0ソフトウェアパッケージを介して計算が実行されました。得られた確率係数Pが有意水準α0.05よりも少ない場合、グループ間の違いは統計的に有意であると見なされました。
1744257857
#実験モデルシステムにおける新しい鼻薬インターフェロンα2B活性の期間の評価 #Virology #Journal
2025-04-10 03:37:00