研究デザイン
ブラジルのリオデジャネイロの低所得地域にあるブラジル統一保健システムの公立保健センターで、妊娠第3期（28～35週）の産前ケアの予約時に、147人の妊婦の非確率的サンプルが募集されました。データ収集は2017年2月から2019年4月の間に行われました。この研究は探索的研究として概念化され、プロトコルは既に他の場所で説明されています33,34。
主な研究の適格基準は、公衆衛生センターの管轄区域内に居住していること、年齢が 18 歳から 40 歳であること、感染性または慢性の非感染性疾患 (肥満を除く) を呈していないこと、および単胎妊娠であることなどでした。除外基準は、研究期間中の妊娠病状の発症、早産または死産、および何らかの疾患のある新生児の出産でした。
この原稿では、出生時の体重と身長のデータ、妊娠中の血液サンプル採取、産後1か月（n = 86）、6か月（n = 70）、または12か月（n = 58）の時点で少なくとも1回の訪問中の子供の成長および/または発達のデータを含む適格基準を満たした98人の母親ペアのサブセットのデータを使用しています（図5）。
図5
研究対象コホートのデータ収集のフローチャート。注: 少なくとも 1 回の訪問で妊娠および発育時のメタボローム データを取得した参加者の総数は 95 人、12 か月時点では 57 人でした。
母体血液サンプル採取
女性の血液サンプルの採取は妊娠28週から35週の間の午前中に行われ、採血前に8～12時間の絶食が必要でした。採取は研究チームに所属する訓練を受けた看護師によって行われました。
サンプルは採取後ホモジェナイズされ、完全に凝固するまでラック内で保持された。30分後、サンプルは遠心分離（1100～1300グ）を4℃で20分間インキュベートして血清のアリコートを得た。その後、血清アリコート（1mL）をさらなる分析まで−80℃で低温チューブに保存した。
メタボローム解析
血清サンプルは、標的メタボロミクスプラットフォームを使用して分析され、AbsoluteID p180アッセイ（Biocrates Life Sciences、インスブルック、オーストリア）を使用して、アミノ酸、生体アミン、アシルカルニチン、LPC、ジアシルホスファチジルコリン（PC）、アルキル：アシルホスファチジルコリン（PC-O）、スフィンゴミエリンを含む合計132の代謝物を識別および定量化しました。 [SM(OH)] および水酸化なし（SM）およびヘキソースの合計（補足表1）。
LC-MS システムには、エレクトロスプレー (ESI) によるイオン化モードの QTRAP 6500+ に接続された UHPLC システムの Sciex ExionL シリーズ (AB Sciex、ダルムシュタット、ドイツ) が含まれていました。サンプル 5 µL を、p180 の指示に従って 5.8 分のグラジエントで、溶媒 A として 0.2% ギ酸水溶液、溶媒 B として 0.2% ギ酸アセトニトリル水溶液を含む p180 アッセイを備えた UHLPC カラムに注入しました。FIA 分析中、サンプル 15 µL にメタノールを注入しました。すべての代謝物はポジティブ モードで識別され、多重反応モニタリング (MRM) 法に従って定量化されました。
アミノ酸と生体アミンは、同位体標識された内部標準に基づいて定量され、7 点の検量線とメタボローム データが処理されました。アシルカルニチン、LPC、PC、SM、ヘキソースなどの他の代謝物は、MetIDQ™ ソフトウェア (Biocrates Life Sciences、インスブルック、オーストリア) で 14 の内部標準を使用して半定量されました。代謝物濃度は µM でエクスポートされ、75% を超える血清サンプルで検出限界を超える濃度の代謝物のみが統計分析に含められました。すべてのデータ取得と処理は、AB Sciex Analyst バージョン 1.7.2 ソフトウェア (SCIEX、トロント、カナダ) によって適用されました。
子どもの成長
出産時の体重と身長は、1 回目の訪問時に子どもの健康手帳から収集され、その後の測定値は、体重 (cm)、身長 (cm)、頭囲 (cm) を含め、2 回目、4 回目、5 回目の訪問時に評価されました。これらの測定は、訓練を受けた面接担当者によって実施されました。
子どもたちは衣服やアクセサリーを身につけていない状態で、Seca モデル 336 体重計 (Seca、ドイツ、ハンブルク) を使用して体重を測りました。身長は、Seca モデル 417 乳児体重計 (Seca、ドイツ、ハンブルク) を使用して測定しました。頭囲の測定は、Seca モデル 211 (Seca、ドイツ、ハンブルク) の使い捨てメジャーを使用して行いました。身長と頭囲の測定は 2 回行いました。身長の差が 0.5 cm、頭囲の差が 0.2 cm の範囲内であれば、算術平均を算出しました。差がこれらの値より大きい場合は、3 回目の測定が必要でした。
年齢相応の体重、年齢相応の身長/体長、年齢相応の体重、体長相応のBMI、年齢相応の頭囲の指標は、世界保健機関（WHO）の成長基準35に従って子供の成長を評価するために使用された。パッケージ 人類 RStudio の z スコアを分類するために使用されました35,36。
小児発達
共変量
ベースラインでは、構造化された質問票を実施し、母親の年齢（歳）、自己申告による肌の色（白人、茶色/混血、黒人、黄色）、教育（就学年数）、婚姻状況（パートナーと同居または別居）、出産回数（初産または経産）、喫煙状況（妊娠中の喫煙）、妊娠期間中のアルコール摂取量、および自己申告による妊娠前体重に関するデータを収集しました。
母親のPP-BMI（kg/m2）は、出産後28～50日に測定された妊娠前の体重（kg）と身長の自己申告に基づいて計算され、低体重（2）、標準体重（≥ 18.5～2）、太りすぎ（≥ 25.0～2）、肥満（≥ 30.0 kg/m2）40に分類されました。
統計分析
変数の正規性は、シャピロ・ウィルク検定を使用して調査しました。カテゴリ変数には絶対頻度 (n) と相対頻度 (%) を使用し、量的変数には中央値と四分位範囲 (IQR) を使用しました。対数変換されたデータの中央値 ± 5 標準偏差を持つ代謝物の値は外れ値と見なされました43。外れ値分析により、下流の分析から 0.16% (n = 25) の測定値が除外されました。
縦断的線形混合効果 (LME) モデルを使用して、最初の 1 年間の成長と発達のパラメータの軌跡グラフを作成し、最初の 1 年間 (日数) のスコアの軌跡の差を評価しました。
LME モデルは、出産後 1 年間の母親の妊娠後期の代謝物と子供の成長および発達との関連性を評価しました。ランダム切片および傾斜モデルは、「lme4」および「lmerTest」パッケージを使用して実行されました。ループ繰り返しモデルを使用して、応答変数と 132 個の代謝物のそれぞれとの関連性を評価しました。時間モデルのランダム傾斜のパフォーマンスは、統計的有意性を確認するために ANOVA を使用したスパゲッティ プロットおよび赤池情報量基準 (AIC) を使用して評価されました。線形混合効果モデルを使用して尤度比検定を実装し、応答変数と日数の間の相互作用項を使用する必要性を確認しました。すべての LME モデルは、モデルの適合を最適化するために ‘lmerControl(“bobyqa”)’ 構成を使用して実装されました。
交絡因子は、無料で入手できるDAGittyソフトウェアを使用してDAGに基づいて定義された。 (オランダ、ラドバウド大学、コンピューティングおよび情報科学研究所、ヨハネス・テキストル)44。DAG は、最新の文献レビューに基づいて交絡変数の十分な最小調整セットを特定するのに役立ちます。最小調整は、変数間の因果関係から得られます。DAG は、妊娠期間と PP-BMI が LME モデルの最小調整として適用されたことを示唆しています (補足図 1)。
モデルの品質は、残差モデルに基づいて実行された分位点-分位点 (QQ) プロットを使用して評価されました。残差は、子どもの発達を除いて、かなり正規分布を示しました。子どもの発達のスコアは、より優れた残差分布を得るためにボックス コックス変換されました。
調整されたp値（q値）が45のとき、結果は統計的に有意であるとみなされた。他の分析では、p値は
倫理的側面
研究プロトコルはヘルシンキ宣言に定められたガイドラインに従い、リオデジャネイロ市保健局倫理委員会（No. 49218115.0.3001.5279）およびリオデジャネイロ連邦大学産科学校倫理委員会（No. 49218115.0.0000.5275）の承認を受けています。参加者は、書面によるインフォームドコンセントに自由意志で自発的に署名しました。
#妊娠後期の母体血清メタボロームと生後1年間の子どもの成長と発達との関連性