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2024-03-02 06:48:56
患者と血漿サンプル
2020年3月から2022年10月までに唐山労働病院で腫瘍切除または一次減量手術を受けた合計78人のEOC患者がこの後ろ向き研究に登録された。 包含基準は以下の通りであった：全ての患者は、国際婦人科産科連盟（ＦＩＧＯ）ステージＩ〜ＩＶで新たにＥＯＣと診断され、外科的治療に適している。 初期段階のOC（ステージIまたはII）が疑われる場合、ステージを決定して癌を切除するために、ステージ分類手術が行われました。 がんが広範囲に広がった進行期OC（ステージIIIまたはIV）の場合、目に見えるがんをすべて除去するために減量手術または細胞減少手術が行われました。 [22]。 すべての患者は術後の病理検査により EOC であることが確認されました。
さらに、上皮性良性卵巣腫瘍を有する同年齢患者40名（良性漿液性嚢胞腺腫19名、粘液性嚢胞腺腫11名、腺房細胞腫瘍6名、成熟奇形腫4名）と健康対照（HC）52名が研究に含まれた。 手術前に抗腫瘍治療を受けたEOC患者は研究から除外された。 健康なボランティアには腫瘍やその他の免疫疾患や代謝疾患はありませんでした。 血液サンプルの使用については、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。 本研究は唐山労働病院の機関研究倫理委員会によって承認された。
各参加者から血液サンプル (10 mL) を血漿分離チューブに収集し、1 時間以内に処理しました。 生細胞および細胞破片を除去するために、4℃、2000×gで10分間遠心分離することによって血漿を得た。 上清を収集し、さらなる分析のために -80 °C で保存しました。
血漿エクソソームの分離
血漿エクソソームは、前述のように超遠心分離法を使用して抽出されました。 [23]。 簡単に言うと、血漿を4℃で解凍し、3000×gで10分間遠心分離して破片を除去した。 次に、超遠心分離機 (Beckman Coulter、Brea、CA、USA) を使用して、上清を 10,000 xg で 30 分間、4 °C で超遠心分離しました。 続いて、別の超遠心分離ステップを 100,000 xg、4 °C で 120 分間実行して、エキソソームを濃縮しました。 ペレットを２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１００，０００×ｇ、４℃で１２０分間の超遠心分離によって回収した。 PBS に再懸濁した後、エクソソームはさらなる分析のために -80 °C で保存されました。
透過型電子顕微鏡 (TEM)
エクソソームペレットを 4 °C で解凍し、PBS に再懸濁しました。 20 μL の懸濁液を、直径 2 nm の炭素被覆銅グリッドのメッシュ上に置きました。 ろ紙で水を切った後、サンプルを 1% グルタルアルデヒドで 5 分間固定しました。 次いで、グリッドをｄｄＨ２Ｏで５回洗浄し、室温で３分間、３％リンタングステン酸でネガティブ染色した。 さらに ddH2O で各 15 分間 3 回洗浄した後、グリッドを空気中で室温で 5 ～ 10 分間乾燥させました。 エキソソームは透過型電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で観察および写真撮影されました。
ウェスタンブロッティング分析
A2780細胞および血漿由来エキソソームを放射免疫沈降溶解緩衝液（Beyotime、江蘇省、中国）で溶解し、12,000×g、4℃で15分間の遠心分離によって総タンパク質を得た。 ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキット（Beyotime）を使用して定量した後、等量の細胞タンパク質とエキソソームタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜（Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）に転写しました。 膜を、0.1% Tween 20 (TBST) を含む Tris 緩衝生理食塩水中の 10% 脱脂乳で 1 時間ブロックし、その後、抗 GM130 (Abcam ab52649; 1:1000) を含む一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。抗 HSP70 (Abcam ab2787; 1:1000)、および抗 CD9 (Abcam ab236630; 1:1000)。 TBSTで3回洗浄した後、メンブレンを適切なHRP結合二次抗体、ヤギ抗ウサギIgG H&L (HRP) (Abcam ab97051; 1:2000)またはヤギ抗マウスIgG H&L (HRP) (Abcam ab205719; 1:2000)とともにインキュベートしました。 1:2000)、必要に応じて、室温で 1 時間放置します。 最後に、電気化学発光システム (PerkinElmer Life Science、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を備えた BeyoECL Plus 化学発光キット (Beyotime) を使用して、タンパク質のバンドを写真フィルム上で視覚化しました。
エキソソーム miRNA 抽出、逆転写、およびリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR)
総エキソソーム miRNA は、メーカーのプロトコールに従って miRNeasy Micro キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して抽出しました。 RNA の質と量は、Agilent Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、メーカーの標準手順に従って測定しました。 エキソソーム miR-223 の定量は RT-qPCR によって評価されました。 まず、メーカーの指示に従って、Hispec バッファーを備えた miScript II RT キット (Qiagen) を使用して、全エキソソーム miRNA を cDNA に逆転写しました。 簡単に説明すると、成熟 miRNA はポリ (A) ポリメラーゼによってポリアデニル化され、オリゴ dT プライマーを使用して cDNA に逆転写されました。 ポリアデニル化と逆転写は同じチューブ内で並行して実行されました。 オリゴ dT プライマーは 3′ 縮重アンカーと 5′ 末端にユニバーサル タグ配列を備えており、リアルタイム PCR ステップでの成熟 miRNA の増幅を可能にします。 cDNA の増幅は、メーカーの指示に従って、ターゲット特異的 miScript プライマー アッセイおよび miScript ユニバーサル プライマー (リバース プライマー) と QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) を含む miScript SYBR Green PCR キットを使用して実行しました。 標的特異的プライマーは次のとおりでした: miR-223 フォワード、5′-AGCCGTGTCAGTTTGTCAAAT-3’。 逆方向、5′-GTGCAGGTCCGAGGTC-3′; U6 順方向、5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、逆方向、5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。 miR-223 および U6 の qPCR 検出用の 20 µL 反応システムには、10 µL 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、2 µL 10x miScript Universal Primer (リバース プライマー)、2 µL 10x miScript Primer Assay (特定のフォワード プライマー)、 4 μL dH2O、および 2 μL cDNA。 qPCR 条件は次のとおりです。CFX-96 リアルタイムで 95 °C で 10 分間の予備変性、その後 95 °C で 15 秒の変性と 60 °C で 60 秒のアニーリング/伸長を 40 サイクル行いました。 PCR 検出システム (Bio-Rad)。 核内低分子 RNA U6 (U6 snRNA) を内部標準として使用し、2-ΔΔCt 法 (ΔCt = Ct) を使用して相対定量を計算しました。 [miRNA] – CT [U6]。
血漿CA125の定量
血漿CA125レベルは、市販のELISAキット(R&D Systems)を製造業者の指示に従って使用して定量した。 簡単に説明すると、96 ウェル ストリップ プレートの各ウェルに Assay Diluent RD 1X 100 μL を添加した後、標準、コントロール、または 2 倍希釈 EDTA 血漿 100 μL を各ウェルに添加し、プレートを 2 時間インキュベートしました。室温で水平軌道マイクロプレートシェーカー上で。 各ウェルを 4 回洗浄した後、200 μL のヒト CA125 コンジュゲートを各ウェルに添加し、シェーカー上で室温で 2 時間インキュベートしました。 次に、200 μL の基質溶液を各ウェルに添加し、光から保護しながら室温で 30 分間インキュベートしました。 最後に、50 μL の Stop Solution を各ウェルに添加しました。 各ウェルの光学密度 (OD) を、450 nm に設定したマイクロプレート リーダーを使用して 30 分以内に測定しました。 CA125濃度は標準曲線に従って計算されました。
統計分析
統計分析は、SPSS20.0 (IBM、米国イリノイ州シカゴ) および GraphPad Prism 9 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。 特に指定しない限り、データは平均±標準偏差 (SD) として表示されました。 一元配置分散分析を使用して、3 つ以上のグループ間の比較を分析しました。 p 値 ≤ 0.05 を統計的有意性があるとみなしました。 スピアマン相関分析および線形回帰を実行して、血漿エキソソーム miR-223 と血漿 CA125 の間の相関をテストしました。 受信者動作特性 (ROC) 曲線分析と曲線下面積 (AUC) を使用して、血漿エキソソーム miR-223、CA125、およびそれらの組み合わせの診断価値を評価しました。 EOC 診断におけるエクソソーム miR-223 および CA125 のカットオフ値は、Youden 法を使用して決定され、Youden 指数 (感度 + 特異度 − 1) が最大になるカットポイントを選択しました。
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