倫理の承認と参加への同意
この研究におけるヒト臍帯血（UCB）実験に対するすべての実験的プロトコルとドナー情報に基づいた同意は、タマサット大学のヒト研究倫理委員会（医学）によって承認されました。 COAの数100/2021; MTU-EC-DS-6-052/64、ヘルシンキ宣言、ベルモントレポート、およびICH-GCP、承認日：2021年4月26日。また、すべての方法は関連するガイドラインと規制に従って実行されました。すべてのドナーは、サンプリング前に参加者の情報シートとインフォームドコンセントに署名しました。
UCB-CD34+細胞の分離とin vitro培養
新鮮な全臍帯血からの高度に精製されたCD34+細胞は、簡単な2段階の手順を使用して得られました。第一に、造血前駆細胞は、Rosettesep™ヒトCORD BLOOD CD34+ Pre-Enrichmentカクテル（Stemcell Technologies、Canada）を使用して事前に豊富になりました。次に、CD34+細胞は、メーカーのプロトコル（Stemcell Technologies、Canada）に従って、EasySep™臍帯ヒトCD34ポジティブセレクションキットを使用して磁気分離によって選択されました。
CD34+細胞の純度を決定するために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のAPC標識抗ヒトCD34+（BD; 555824）で分離細胞を4°Cで30分間染色しました。次に、染色された細胞をPBSで洗浄し、DX Flex（Beckman-Coulter）フローサイトメーターを使用して分析しました。 UCB-CD34+細胞の純度は、フローサイトメトリーによって95％を超えると決定されました。 in vitro培養では、50 ng/ml幹細胞因子（SCF）、50 ng/mLトロンボポエチン（TPO）、20 ng/ml FLT-3 ligand（FLT-3 L-Ligand（flt-3 L-6）（20 ng/ml-6（20 ng/ml-6（20 ng/ml）を添加したSTEMSPAN™拡張培地（STEMCELLテクノロジー、カナダ）で分離されたUCB-CD34+細胞を培養しました。 Ng/ml可溶性IL-6受容体（SIL-6R）（すべて米国ペプロテクから）、および1％（v/v）ペニシリン/ストレプトマイシン（P/S）（Merck Millipore、US）で37°Cで、空気中の5％CO2で洗い流しました。
細胞生存率アッセイ
UCB-CD34+細胞の生存率のAPの最適な用量を決定するために、MTSアッセイを実施しました。簡単に言えば、細胞を1,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、異なる濃度のAP（図1A、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を3、5、および7日間播種しました。対照細胞は、メタノールの0.01％を持つ等量の培地を受け取ります。示された時点で、各ウェルに100 µLのMTS（プロメガ）を加え、37°Cの暗所で4時間インキュベートしました。吸光度は490 nmで測定されました。すべてのグループはコントロールグループに正規化されました。すべてのデータは、3つの独立した実験から収集されました。
拡大した細胞における細胞増殖と免疫表現型分析
UCB-CD34+細胞の増殖は、FITC BRDUフローキット（BD Biosciences San Jose、CA、USA）によって評価され、フローサイトメトリーによって分析されました。簡単に言えば、BRDUを細胞培養培地に最終濃度10 µMで加え、37°Cで2時間インキュベートし、収集し、1500 rpmで5分間遠心分離しました。収穫された細胞を一度洗浄し、固定し、その後透過性を透過し、Cytoperm透過緩衝液プラスに再懸濁しました。 300 gで6分間遠心分離した後、細胞をDNaseで処理し、300 µg/mL DNaseを含む溶液に再懸濁しました。組み込まれたBRDUを暴露するためにDNaseで細胞を処理した後、細胞を37°Cで1時間暗闇でインキュベートし、BD Perm/洗浄バッファーを洗浄しました。蛍光抗体でブルドゥを染色する。細胞を、希釈蛍光抗Brduを含む50 µLのBDパーマ/洗浄バッファーで再懸濁し、室温で20分間暗所でインキュベートしました。 1mlの1x Perm/Washバッファーで細胞を洗浄し、分析をフローサイトメトリー（DX Flex、Beckman-Coulter）によって実行しました。データは、Brdu陽性細胞の割合として表されました。
表現型分析のために、細胞を収集し、次の抗体とフルオロフォアの組み合わせを添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で30〜60分間染色しました：APC標識抗ヒューマンCD34（BD; 555824）、PE-CY7標識抗ハマンCD38（BD; 5677（BD; APC-H7標識抗ヒトCD45RA（BD; 560674）、およびBV421標識抗ヒトCD90（BD; 562556）。少なくとも104のイベントを実行すると、拡張細胞の細胞表現型は、dxFlexソフトウェアバージョン2.0（米国カリフォルニア州ブレア、Beckman Coulter、Brea、Brea、CA、Brea、Brea、Brea、Brea、Brea、Brea）によって分析されました（Beckman Coulter、Brea、Brea、CA）https://www.beckman.com/flow-cytometry/research-flow-cytometers/cytoflex/software）。
細胞周期分析
UCB-CD34+細胞を氷寒色PBSで洗浄し、寒冷70％エタノールで-20°Cで少なくとも2時間固定し、透過化しました。その後、細胞ペレットを0.5 mL Pi/RNase染色バッファー（BD Biosciences）で室温で室温で15分間染色し、DxFlexフローサイトメーター（Beckman Coulter、Brea、CA、USA）によってDxFlexソフトウェアバージョンのCytexpertを使用して実行されました。https://www.beckman.com/flow-cytometry/research-flow-cytometers/cytoflex/software）。
老化関連β-ガラクトシダーゼ（SA-β-GAL）染色
UCB-CD34+細胞は、メーカーのプロトコル（Cell Signaling Technology、Danvers、MA、USA）に続いてSA-β-GAL活性のために染色されました。手短に言えば、HSC（106）は、室温で4％パラホルムアルデヒドで15分間固定されました。細胞をPBSで洗浄し、β-ガラクトシダーゼ染色溶液でCO2なしで16時間37°Cでインキュベートしました。総細胞400個あたりのβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞の数は、顕微鏡下でカウントされました（Nikon TS100、日本）。
コロニー形成ユニットアッセイ
UCB-CD34+細胞は、APを2.5µm、5µmを7日間含む膨張培地で培養しました。治療後、CD34+マイクロビードキットを使用して細胞を再度ソートしました。次に、50 ng/mlのヒトSCF、10 ng/mlヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、10 ng/mlヒトIL-3、および3 IU/ML Human Epgrapraprideogiesを含む10 ng/mlのヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含むメチルセルロースベースの媒体（カナダの幹細胞技術）に500個のソートされた細胞を播種しました。 14日間の培養後、バーストフォーミングユニットエリトロイド（BFU-E）、CFU顆粒球マクロファージ（CFU-GM）、およびCFU顆粒球 – 細胞球マクロファージ – メガカリャリ球（CFUS-GEMM）を含むコロニーは、微小顕微鏡下で数えられました。細胞を超えるコロニーのみが陽性のコロニーとしてカウントされました。
RNA抽出および定量的RT-QPCR分析
UCB- CD34+細胞の総RNAは、製造元の指示に従ってRNEASY Miniキット（カリフォルニア州Qiagen）を使用して抽出されました。 RNAサンプルの完全性と品質は、Nano滴（ND-1000）分光光度計（Thermo Fisher Scientific、米国）を使用して評価されました。次に、500ナノグラムの総RNAを、iScript Select CDNA合成キット（Bio-Rad Laboratories Inc）を使用して転写を逆転写しました。 ITAQ Universal Sybr Green SuperMix（Bio-Rad Laboratories Inc.）は、QRT-QPCRで使用され、ABI Step One Plus（Applied Biosystems、CA、USA）を使用して実行されました。データは、比較しきい値サイクル値（2 -ΔΔCT）メソッドを使用して、StepOneソフトウェアバージョン2.3を使用して分析されました（https://www.thermofisher.com/id/en/home/technical-resources/software-downloads/stepone-and-steponeplus-real-time-pcr-system.html）。 GAPDH正規化された転写データは、相対遺伝子発現として示されています。 QRT-QPCRのプライマーシーケンスを表1に示します。
表1定量的RT-QPCR分析に使用されるヒトプライマー配列。
ナノストリング分析
ナノストリングNCounter分析システムは、デジタル蛍光バーコードテクノロジーを採用して、遺伝子発現（mRNA）の直接的な多重化測定を促進します。 100 ngのRNAをハイブリダイズし、その後、NCounter®幹細胞パネルの770遺伝子に関するメーカーの指示に従って、Nanostring Prep StationとNCounter（Nanostring Technologies）を使用して処理しました。結果を29のハウスキーピング遺伝子で正規化しました。すべてのヒートマップは、NSOLVER 4.0 NANOSTRING NSOLVERソフトウェアの高度な分析パッケージを使用して作成されました（https://nanostring.com/products/ncounter-analysis-system/ncounter-analysis-solutions/）。
統計分析
データは平均±SEMとして表されます。グループ間の比較は、一方向ANOVAを使用して行われ、それに続いてDunnettの多重比較テストが行われました。 GraphPad Prism 10 Statistical Analysis Software（GraphPad Software Inc.、San Diego、CA、USA、 https://www.graphpad.com/features#analysis）。差は、0.05未満のp値で統計的に有意であると見なされました。
#アンドログラフ化はヒト臍帯血に由来するCD34造血幹細胞のex #vivo拡大を促進します