DNA の配列を決定する方法

「本当に痛いです」

指からは血が滴り落ちます。

「神様…私にやってほしいですか？」
「確かに、そうですね」

私がそれ以上何も言う前に、彼女は再び私の指に針を刺しました。そしてまた。そしてまた。

私の小指に沿ってさらに血が流れ、私の目は涙を流し、彼女は試験管の上で私の指を圧迫しました。

「分かった、掃除に行ってもいいよ。」

最初のヒトゲノムの解読には23億ドルと13年を要した。

現在、オックスフォード ナノポア (1000 ドル) を使用すると、必要な DNA を 48 時間以内に配列することができます。彼らのマーケティング資料にはそう書かれています。

現時点で、自分自身の DNA 配列を解析したい場合は、血液か頬綿棒を怪しい第三者に送らなければなりません。私の知る限りでは、その第三者は深センの暗い片隅で、他の 10,000 人の DNA が入った USB メモリに私の DNA を渡しているのです。

何人かの友人と私は興味を持ちました。 寝室にある間に合わせの装置を使ってナノポアを購入し、DNA を配列するのはどれほど難しいでしょうか?

目標は、10 ml の血液から 30 億個の A、C、G、T の文字列を生成することです。

大まかな手順は非常に簡単です。

1. 血液サンプルを採取する

2. 他のすべてのグープから人間の DNA を抽出する

3. 小さな電気穴に DNA を通すことで、ナノポアが各 DNA 断片の個々の塩基対を読み取ることができます。

装置の説明に入る前に、DNA 配列決定が長年にわたってどのように変化したかについて技術的な余談をさせてください。

DNA 配列決定の 3 つの時代の概要 この素晴らしい紙。

1. サンガー時代: ベリースロー (1960-2003)

サンガーら。 DNA ポリメラーゼに欠陥のあるヌクレオチドを供給することで、特定の塩基対で DNA ポリメラーゼを停止できることを発見しました。欠陥のあるヌクレオチドの束を追加すると、これは多かれ少なかれランダムに発生し、その結果、異なる長さの DNA 鎖の束が生成されます。

ゲルに電流を加えると、小さな部分が分離します。その後、バーコードのようにバンドを読み取ることができます。

このアプローチでは、ヒトゲノム (約 30 億 bp) を解析するのに 13 年と 23 億ドルかかりました。

2. イルミナ時代: 並列化 (2005 ～ 2010 年代)

「合成による配列決定」。各塩基対を切り刻んでゲル格子を通して分離する代わりに、

3. 単一分子シークエンシング

現在、電気ナノポアを使用して、各塩基対の個々の電荷を読み取ります。何も切り刻む必要はなく、処理された DNA がほどかれ、小さな穴を通過します。各塩基対は、穴を通して引っ張られた分子紐上のビーズのようなものです

これが私たちが使用したアプローチです。

• オックスフォード ナノポア MinION スターター キット ($1,000) – USB シーケンサー、小さな生物学的細孔を備えたフローセル、および前処理用化学薬品が含まれます。

• Zymo DNA 抽出キット (Web サイトからの無料サンプル)

• Amazon のミニ遠心分離機 ($50) – 高速回転

• ラボ消耗品: エッペンドルフ チューブ、ランセット、ピペット ($50)

総コスト: ~1,100 ドル

200 μL (ml の約 1/5) の血液を採取する必要がありました。

私が購入した糖尿病用ランセットは小さすぎて、各刺し傷からは約 10 µL しか得られなかったというひどい間違いを犯しました。私の指を何度も刺すのは当然のことながら恐ろしかったので、Cece さんは親切にもランセットを手に取り、絞り出すことができる複数の小さなビーズができるまで私の小指に急速に突き刺しました。

血液自体には、このような汚れがすべて含まれています。そのほとんどは DNA さえ持たない赤血球です。白血球の細胞膜を溶解し、この DNA を分離する必要があります。 Zymo キットは、適切な酵素と、遠心分離機にかけたときにフィルターとして機能する特別な試験管を提供してくれました。私たちはフォローしました 指示 弊社のサーマルサイクラーを使用しましたが、問題なく動作しました。

次に、ナノポア準備キットに従わなければなりませんでした。これは基本的にアダプター分子を取り付けて、ナノポアが何を読んでいるかを認識できるようにするものでした。

私たちは、調製した DNA を MinION フローセル (筆箱より小さいデバイス) の小さなポートにピペットで移しました。私たちは全体を USB ポートに接続し、MinKNOW ソフトウェアを起動し、ソフトウェアが「ベースコーリング」を行う様子をリアルタイムで観察しました。私の知る限り、ソフトウェアは電気信号をニューラル ネットに送り、リアルタイムで署名を A、T、C、または G として予測します。

したがって、結果は基本的に分析には役に立たなかったと認めざるを得ません。

2 回の実行で合計約 1 ギガベースのシーケンスを実行しました (最初の実行はハードウェア エラー中に停止しました)。ヒトゲノムは約 3 ギガベースなので、約 13% をカバーします。もう一つの問題は、私たちが配列決定したものの 75% が実際にはヒトの DNA であり、残りの 25% は何らかの形の細菌汚染であったことです。

私は自分の一塩基多型 (乳糖耐性遺伝子、乳がん遺伝子など) を調べたかったのです。自信を持って SNP を呼び出すには、同じセクションを複数回シーケンスする必要があります。ほとんどのスポットのシーケンスは 0 回または 1 回でした。

もう 1 つの問題は、フロー セルが最初から機能不全に陥っていたことです。2048 個の細孔のうち 623 個しか機能していませんでした。

まだ！ 1100 ドルで私のヒトゲノムの意味のある部分の配列を決定しました。

謝辞

この実験を一緒に行ってくれた親愛なる友人の Lenni、Cece、S に感謝します。