第一胃リポ多糖類が純粋培養細菌の増殖および発酵最終産物に及ぼす影響

研究でルーメン液のドナーとして使用された動物を含むすべての実験手順は、フロリダ大学機関動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルの下で実施されました。 また、すべてのメソッドは、IACUC のガイドラインと規制に従って実行されました。 以下の調査は、ARRIVE ガイドラインに従って報告されています。

統計分析

各処理は、少なくとも 3 つの生物学的複製 (n ≥ 3) でテストされ、テストされた株ごとに合計サンプルサイズ n = 12 でした。 意義が宣言された P ≤ 0.05、一方で 0.05 < の傾向P ≤ 0.10。

ロジスティック関数を使用して、成長率 (μ) とラグ タイム (lag) を予測しました。 によると41、使用されたロジスティック関数は次のとおりです。

$$Y={y}_{0}+frac{C}{left(1+{exp}^{left)[4*mu max*frac{lag-t}{C}+2right]}右)}$$

Y は実数 ODt, y は初期ODです、μmax は最大比増殖率、C は OD からの OD の増加です。t.

予測された最大比成長率とラグ タイムは、SAS 分析の入力として使用されました。 最大比増殖速度、遅延時間、およびアンモニア、有機酸の濃度に対する処理の効果を、SAS の MIXED 手順を使用した最小二乗分散分析 (ANOVA) を使用して分析しました。

使用した統計モデルは次のとおりです。

$${y}_{i}=mu +{T}_{i}+{E}_{j}+{varepsilon}_{ij}$$

ここで、y は従属変数、μ は全体の平均、 ({T}_{i}) 治療の固定効果であり、({E}_{j}) 実験的な実行であり、 ({varepsilon}_{ij}) ランダムエラーです。 実験の実行はランダム効果と見なされました。

ルーメン液の分画

第一胃にカニューレを挿入したホルスタイン種の牛から、総混合飼料 (DM 基準: 60% 全草トウモロコシサイレージ、12.5% 粉砕トウモロコシ、13% 柑橘類パルプ、12% 大豆粕、および 2.5% ミネラルとビタミン) を自由に給餌して、第一胃液を採取しました。ミックス)。 朝の給餌の約 3 時間後、反芻胃の内容物を手動で収集し (7 L)、4 層のガーゼを通して予熱した魔法瓶に濾し、すぐに研究室に運びました。 内容物を 2 層チーズクロスで再度濾し、ビーカーに移し、氷に 15 分間浸しました。 濾した第一胃液(約14L)を連続して3回遠心分離した(Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge、DuPont Instruments(登録商標)Wilmington、DE)。 最初は1000×g 10分間、その後上清を回収し、11,250×で再度遠心分離したg その後、得られたバクテリアペレットをMilli-Q水に再懸濁し、16,250×で3回目の遠心分離を行いましたg ミリ Q 水で後で再懸濁された細菌のペレットを取得する 20 分間。 最後に、細菌ペレットを発熱物質を含まないチューブに移し、ホモジナイズし、Milli-Q 水を使用して 15 mL に希釈し、後の反芻胃 LPS 抽出のために -80 °C で保存しました。

ルーメンリポ多糖抽出

前述のように、修正されたホットフェノール抽出を利用して、第一胃にカニューレを挿入した牛から得られた第一胃細菌からLPSを抽出しました42,43 ただし、以下で説明するマイナーな変更と検証が行われています。 簡単に言えば、ルーメン液から総LPSを分離するために、ヒートブロックを使用して細菌ペレットを100〜110°Cで30分間沸騰させた後、50 mLのMilli-Q水を加えました。 次に、細菌懸濁液を、68°Cで30分間予熱した90%フェノール50mLで処理しました。 次に、調製物を-20°Cに30分間置いて冷却し、5000×で遠心分離しましたg 10分間。 銀染色 (Thermo Scientific™ Pierce™ Silver Stain Kit) でテストした後、最大濃度の LPS を示すため、水 (上部) 層を収集しました。 次に水層を再生セルロース透析膜 (Fisherbrand™) に移し、Milli-Q で 260 nm でフェノールが検出されなくなるまで、4 °C で Milli-Q に対してさらに透析しました。 次に、透析したサンプルを5 mM MgClで処理しました2 続いて、20 μg/mL Dnase I (M0303s、New England Biolabs) を 37 °C で 2 時間、混入している DNA を分解します。 その後、20 μg/mL Rnase H (T3018、New England Biolabs) を 37 °C で 2 時間添加して、混入している RNA を分解し、最後に 30 mg/mL プロテイナーゼ K (Fisher BioReagents™ プロテイナーゼ K、カタログ番号 BP1700- 100) を添加して、タンパク質の混入を除去しました。 次いで、調製物を凍結乾燥し、粗LPS質量を決定した。 凍結乾燥後、乾燥サンプルを 15 mL の Milli-Q 水に再懸濁し、1110 × で遠心分離しました。g固形物を除去するために10分間。 上清を 0.15 mL の 50 mM 酢酸、95% エタノールで処理し、ガラス製パスツール ピペットで超遠心分離チューブ (Quick-Seal® Round-Top ポリプロピレン チューブ) に移し、4 °C、105,000 倍で 8 時間遠心分離しました。 g 超遠心分離機 (optima XE、Beckman Coulter Life Sciences、インディアナポリス、インディアナ州) で。 上清を除去し、LPS ゲルをエンドトキシンを含まない水 2 mL に再懸濁し、凍結乾燥して、純粋な LPS の乾燥重量を測定しました。 第一胃由来の LPS の純度と正規化を確認するために、製造元の指示に従って、Pierce™ Silver Stain Kit (Thermo Scientific™) を使用して最終生成物を視覚化しました。 すべての場合において、Pierce™ Silver Stain Kit は、純粋な細菌分離株から精製された LPS と同じ純度を示しました。

LPSストックの準備

の濃度大腸菌-LPS ( 大腸菌O111:B4、L2630; Sigma-Aldrich Co.、ミズーリ州セントルイス)、反芻胃-LPS および MIX-LPS は 200,000 EU (Sigma-Aldrich プロトコルに基づく 1 ng/mL = 10 EU) でした。

See also  IPL2022予選1| ハルディク・パンディアは、GTでトロフィーを獲得したいという熱烈な願望を持っているとラヴィ・シャストリーは言います

すべての LPS ストックは嫌気性条件下で調製され、25 mg の 大腸菌-LPS を 62.5 mL の無菌嫌気性非発熱性水に加え、CO で洗い流しました。2、0.4 mg/mL を生成する 大腸菌-LPS。 ルーメン LPS ストック (25 mg) を 2 mL の無菌の非発熱性水に再懸濁し、20 分間超音波処理しました。 超音波処理後、ルーメン LPS ストックを嫌気条件下で調製し、無菌の嫌気性非発熱性水で最終容量を 62.5 mL にして、0.4 mg/mL ストックを生成しました。 MIX-LPS ストックの場合、13.5 mL (5.4 mg の 大腸菌-LPS) から 大腸菌 -LPS ストックを 13.5 mL (5.4 mg の第一胃 LPS に等しい) 第一胃 LPS ストックと混合して、0.4 mg/mL の MIX-LPS を生成しました。 次に、すべてのLPSストックを0.45μm、続いて0.22μmのポリエーテルスルホン(PES)メンブレンシリンジフィルター(Celltreat、Pepperell、MA)でろ過し、事前にCO2でフラッシュしてオートクレーブした血清ボトルに入れました。 0.4 mg/mL の 0.5 mL ボリューム 大腸菌 -、反芻胃および MIX-LPS ストックには 200,000 EU の LPS が含まれていました。 第一胃の LPS が等しいと仮定して、0.4 mg/mL の濃度を選択しました。 大腸菌 重量によるLPS。 この仮定は、すべての用量の重量、体積、およびエンドトキシンが類似するようにするために行われました。 MIX ストック ソリューションのエンドトキシンを検証するために、200,000 EU に近いエンドトキシンを示すカブトガニ アメーバ ライセート アッセイを実行しました。

メディア

基礎培地には 240 mg の K が含まれていました。2HPO4、KH 240mg24、480mgの(NH4)2それで4、480mgのNaCl、100mgのMgSO4・7H2O、CaCl 64 mg22H2O、1リットルあたり600mgのシステイン塩酸塩、1gのトリプチケースペプトン(製品212750; BD)、および0.5gの酵母抽出物(製品212750; BD)44; PH 6.5; Oを除去するオートクレーブ (121 ° C、15 分)2 Oの下で冷却2-フリー CO2. 緩衝液として炭酸ナトリウム(4g/L)を加えた。 レサズリンは、酸化還元指示薬として追加されました。 増殖基質を嫌気的に調製し、無菌条件下で基礎培地に導入した。 グルコース (最終濃度 20 mM) を成長基質として添加し、 S.ボビス JB1と 彼自身。 反芻動物 HD4 および 50 mM の乳酸 (最終濃度) を成長基質として添加しました。 M.エルスデニー T81。 すべての培地および培地添加物 (グルコースまたは乳酸) は、純粋培養ルーメン細菌の以前の査読済み研究に基づいています。44 実行間の変動を減らすために同時に準備されました。

生物

乳酸菌 セレノモナス反芻動物 HD4 (一連の管理: Herbert J. Strobel、Michael D. Flythe) および 連鎖球菌ボビス JB1 (CoC: James B. Russell、Michael D. Flythe)、および乳酸を利用する細菌 メガスファエラ・エルスデニー T81 (一連の管理: Paul J. Weimer、Michael D. Flythe) は、ケンタッキー大学キャンパスの ARS、USDA の飼料動物生産研究ユニットで維持されているストック カルチャー コレクションから入手しました。 すべての分離株は、グラム染色および顕微鏡検査によって純度が確認されました45. 各株の遅延、対数、および定常期を決定するために、予備的な成長曲線分析を実施しました (データは示していません)。

細菌増殖の処理と測定

株を10 mLの成長培地(乳酸生産者:基本培地と20 mMグルコース、乳酸利用者:基本培地と50 mM乳酸)に接種し、39°Cで一晩インキュベートしました。 各一晩培養物の光学密度 (OD、吸光度 600 nm) を記録して、成長曲線実験の接種材料を決定しました。 百μl S.ボビス JB1、100μL 彼自身。 反芻動物HD4、または 500 µL M.エルスデニーT81を、0.5mLのLPS処理または対照を含む基礎培地に添加した。 治療は、(i)CTRL、対照群(LPSを含まない嫌気性水)でした。 (ii) RUM、反芻胃-LPS (0.4 mg/mL 反芻胃 LPS); (iii) 大腸菌、 大腸菌-LPS (0.4 mg/mL 大腸菌 -LPS); (iv) MIX、1:1 大腸菌: ルーミナル-LPS (0.4 mg/mL MIX-LPS)。 3 つすべての LPS (RUM、E. COLI、MIX) の濃度は、SARA (200,000 EU) の牛で LPS 濃度を測定した以前の研究に基づいて選択されました。46. すべての実験用チューブを反転して混合し、火炎滅菌し、2 mL をベースラインの発酵最終生成物 (NH3-N、および有機酸) と初期光学密度 (OD)。 すべての菌株は、O 下で嫌気的に増殖しました2-フリー CO2 ハンゲートチューブに入れ、振とうせずに39°Cでインキュベートしました。 光学濃度 (ODt) は、次の場合を除いて 1 時間ごとに記録されました。S.ボビス細菌の増殖がプラトーに達するまで、30分ごとに測定値が収集されたJB1。 細菌の増殖が中間指数期に達したら、2 mL の培地をエッペンドルフ チューブに集め、遠心分離 (15,000 ×g、2分)、発酵最終生成物(NH3-N、および有機酸)。 第一胃で起こる連続発酵条件を表すために、発酵最終生成物のサンプルを中間指数段階で収集しました(図1、2、3)。

See also  私は医者であり、あなたがこれらのビタミンを決して摂取しないように頼みます—これを食べてください

発酵最終製品分析

培地のサンプルを解凍し、遠心分離(15,000×g、2分)、アンモニア濃度はフェノール酸/次亜塩素酸塩法によって決定されました47. 揮発性脂肪酸、乳酸、および可溶性糖の濃度は、HPLC (Dionex、Sunnyvale、CA、USA) によって定量化されました。 カラム (Aminex HP-87H、Bio-Rad、Hercules、CA) を 50 °C、流速 0.4 mL/min、H2 水で操作しました。2それで4 (0.17 N) 移動相。 屈折率検出器 (Shodex/Showa Denko, Kanagawa, Japan) と UV 検出器 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) をタンデムで使用して、溶出化合物を検出しました。

Leave a Reply

Your email address will not be published.

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.

Recent News

Editor's Pick